抑制GPR87基因增強(qiáng)膀胱癌細(xì)胞對(duì)Cisplatin、Pirarubicin的敏感性.pdf

1、背景:
　　膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，如今臨床上膀胱癌患者對(duì)常規(guī)的治療藥物Cisplatin、Pirarubicin的耐藥日益嚴(yán)重，同時(shí)增加了藥物副作用，所以深入研究其相關(guān)耐藥機(jī)制有利于提高膀胱癌患者對(duì)臨床藥物的敏感性，更有利于提高臨床治療膀胱癌的效果。
　　研究思路:
　　基于相關(guān)研究報(bào)道，在基因毒力作用下，結(jié)腸癌細(xì)胞的野生型P53能誘導(dǎo)GPR87的表達(dá)，在干擾GPR87后結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)藥物敏感性提高。因?yàn)镚PR

2、87在膀胱癌中高表達(dá)，由此我們可推測(cè)GPR87可能也與膀胱癌患者耐藥相關(guān)，擬構(gòu)建shRNA表達(dá)載體抑制GPR87在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)，檢測(cè)能否提高膀胱癌細(xì)胞對(duì)Cisplatin、Pirarubicin藥物的敏感性，減少臨床藥物用量，以達(dá)到提高臨床治療膀胱癌的效果。采取主要方法如下:
　　1.通過MTT篩選出Cisplatin、Pirarubicin以及兩藥聯(lián)合作用于BIU87、T24細(xì)胞24 h，抑制率在20％-40％的兩個(gè)濃度，再

3、通過免疫熒光、Western-blot檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷指標(biāo)γ-H2AX蛋白。篩選出最佳的有效損傷濃度。
　　2.分別提取BIU87、T24細(xì)胞被Cisplatin、Pirarubicin及兩種藥聯(lián)損傷24 h后的RNA、蛋白，通過Western-blot、半定量、定量PCR分別檢測(cè)P53、GPR87基因轉(zhuǎn)錄、蛋白水平表達(dá)變化。
　　3.膀胱癌細(xì)胞BIU87、T24轉(zhuǎn)染抑制效率最高的GPR87-1號(hào)基因，應(yīng)用MTT檢測(cè)兩種細(xì)

4、胞對(duì)Cisplatin、Pirarubicin和兩種藥物聯(lián)合作用的敏感性變化，Western-blot檢測(cè)兩種細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白P53、P21、PARP、MDM2表達(dá)變化，免疫熒光檢測(cè)兩種細(xì)胞的細(xì)胞核凋亡形態(tài)變化。
　　取得實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論:
　　1.2μg/ml Cisplatin、0.25μg/ml Pirarubicin、1μg/ml Cisplatin聯(lián)合0.125μg/ml Pirarubicin分別作用BIU87細(xì)

5、胞24 h以及4μg/mlCisplatin、1μg/ml Pirarubicin、2μg/mlCisplatin聯(lián)合0.5μg/mlPirarubicin分別作用T24細(xì)胞24 h，均能到達(dá)有效損傷效果。篩選出的藥物濃度作用BIU87、T24細(xì)胞24 h后，能達(dá)到預(yù)期損傷效果。
　　2.在BIU87細(xì)胞被Cisplatin、Pirarubicin、及兩種藥聯(lián)有效損傷后，P53、GPR87基因的mRNA、蛋白均表達(dá)升高(P＜0.0

6、5)，在T24細(xì)胞被Cisplatin、Pirarubicin、及兩種藥聯(lián)有效損傷后，P53、GPR87的mRNA、蛋白均表達(dá)無(wú)明顯變化，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。BIU87內(nèi)細(xì)胞的野生型P53調(diào)控GPR87的表達(dá)上調(diào)。T24細(xì)胞內(nèi)突變型的P53不能調(diào)控GPR87的表達(dá)。
　　3.GPR87基因被抑制后，BIU87細(xì)胞對(duì)Cisplatin、Pirarubicin和兩種藥聯(lián)合作用的敏感性明顯提高、凋亡相關(guān)蛋白P53、P21、PA