ROS介導的以Nrf2為核心的抗氧化防御體系對肺纖維化的調控機制研究.pdf

1、肺纖維化是一種慢性炎癥間質性疾病，其特征是肺泡區(qū)細胞結構的改變伴隨過度的膠原沉積。肺纖維化的病因還未完全清楚，已有大量證據(jù)表明，活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）在不同形式的肺損傷過程中扮演了重要角色，除了刺激炎癥反應的發(fā)生外，更重要的是大量ROS的爆發(fā)破壞了體內氧化-抗氧化的平衡，使機體失去正常的調節(jié)功能，從而對正常細胞及組織造成損傷并引發(fā)過度修復。Nuclearfactor-erythroid2relate

2、dfactor2(Nrf2)是一種新近發(fā)現(xiàn)的轉錄因子，它可以啟動多種抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的活化。在肺纖維化的發(fā)病過程中，Nrf2及其下游相關的基因發(fā)生了什么變化，它與炎癥反應和膠原代謝之間的關系如何，給與藥物干預后是否能增強Nrf2的轉錄激活進而上調肺部抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶基因的表達以發(fā)揮保護作用，以及這些變化對于最終的病理改變起到何種影響都不十分清楚。因此，研究此通路的變化及其調控作用機制對于深入探討肺纖維化的發(fā)病機理與防治策略具有重

3、要意義。
　　本研究通過建立博來霉素誘發(fā)的小鼠肺纖維化模型，測定肺纖維化過程中氧化應激的相關指標，利用RT-PCR和WesternBlot技術觀察Nrf2及抗氧化酶CAT、SOD、GCS與HO-1mRNA與蛋白表達的變化，體外原代培養(yǎng)肺成纖維細胞，MTT法測定其活力與膠原分泌情況；通過加入H2O2、博來霉素（BLM）和咖啡酸苯乙酯（CAPE），觀察它們單獨或聯(lián)合對L929小鼠胚肺成纖維細胞增殖及膠原合成量的影響，熒光免疫細胞化學法

4、觀察Nrf2在胞內的分布情況，EMSA檢測其DNA結合能力，觀察Nrf2及抗氧化酶CAT、SOD、GCS與HO-1mRNA與蛋白表達的變化，同時流式細胞儀檢測細胞內活性氧的生成情況；采取常規(guī)藥物地塞米松與抗氧化劑咖啡酸苯乙酯單獨或聯(lián)合對動物模型進行干預治療，觀察實驗性治療效果，為深入研究肺纖維化的發(fā)病機理，進一步提高臨床療效和健康需要，提供初步的實驗資料和理論依據(jù)。
　　通過本實驗結果觀察到：（1）在給予動物BLM作用后，肺/體比

5、值升高，肺部纖維化表現(xiàn)明顯，羥脯氨酸含量顯著增加，說明肺纖維化動物模型制作成功。同時發(fā)現(xiàn)，脂質過氧化產物TBARs升高，抗氧化物質GSH減少，而抗氧化酶SOD、CAT活性也逐漸下降，說明體內存在氧化應激。通過測定發(fā)現(xiàn)，肺組織中關鍵轉錄因子Nrf2及抗氧化酶的mRNA與蛋白表達都發(fā)生明顯變化，說明這些基因可能調控著肺部氧化－抗氧化的平衡。另外還發(fā)現(xiàn)，模型動物的成纖維細胞增殖活力比對照組高，而與膠原代謝相關的MMP-1/TIMP-1比例也發(fā)

6、生改變，說明肺纖維化中存在成纖維細胞狀態(tài)與功能的改變。（2）在給予體外培養(yǎng)的L929成纖維細胞低劑量的氧化劑BLM與H2O2時，都可刺激細胞增殖并且膠原分泌增加。同時發(fā)現(xiàn)，BLM與H2O2均可上調細胞內的Nrf2mRNA的表達，但BLM對Nrf2的蛋白與活性下調，H2O2對Nrf2的蛋白表達與活性仍然顯示出上調作用。細胞內的重要抗氧化酶CAT、SOD、γ-GCS、HO-1的表達也發(fā)生變化，且變化趨勢與Nrf2相似。另外，通過對胞內氧化應

7、激指標的觀察發(fā)現(xiàn)，BLM與H2O2引起脂質過氧化產物TBARs的含量增加，CAT、SOD的活性下降，GSH含量降低。給予抗氧化劑，能夠上調Nrf2的表達，影響抗氧化酶表達發(fā)生變化，并提示可能存在劑量效應關系，能夠改善BLM與H2O2所導致的氧化應激的狀態(tài)，同時細胞的增殖活力與膠原分泌也得到抑制。另外，通過RNA干涉沉默Nrf2基因后，發(fā)現(xiàn)幾種抗氧化酶對藥物的敏感性均明顯減弱，說明Nrf2是其表達與活性的核心因子。（3）Nrf2及抗氧化酶

8、的表達變化與H2O2的濃度有一定關聯(lián)，氧化劑與抗氧化劑都會影響胞內的H2O2濃度，CAT變化的不一致提示Nrf2與H2O2存在反饋調節(jié)。低濃度的H2O2會刺激細胞增殖，令胞內氧化－抗氧化狀態(tài)改變。（4）CAPE可以調控Nrf2與抗氧化酶，控制胞內關鍵信號分子H2O2的濃度，改善BLM與H2O2對成纖維細胞的刺激作用，從而實現(xiàn)對肺成纖維細胞狀態(tài)的調節(jié)，它對Nrf2的活化機制可能與其結構有關。CAPE對肺纖維化動物模型有一定的治療效果。（5

9、）發(fā)現(xiàn)BLM致肺纖維化作用可能存在的新機制在于其對Nrf2或抗氧化酶的蛋白毒性。
　　本課題通過博來霉素誘發(fā)的肺纖維化動物模型，初步探討了ROS介導的以Nrf2為核心的抗氧化防御體系對肺纖維化的調控機制，并且取得了一定進展。發(fā)現(xiàn)ROS可以通過調節(jié)Nrf2介導的抗氧化酶的改變影響肺成纖維細胞的狀態(tài)與功能。H2O2是機體調控氧化－抗氧化平衡的關鍵分子，闡明ROS介導的以Nrf2為核心的抗氧化防御系統(tǒng)的改變是肺纖維化中氧化－抗氧化失衡的