ADC病人HIV-1gp120基因多樣性分析及對U87細胞分泌TNF-α與IL-1β的影響.pdf

1、目的：
　　 影響ADC發(fā)病的主要因素有HIV-1病毒的致病性、機體的神經(jīng)易感性及免疫抑制的水平。研究表明大腦及腦脊液中HIV病毒載量與ADC的發(fā)生并非總是有關,這說明ADC的發(fā)生可能與HIV本身的基因及生物學活性有關。鑒于HIV-1gp120在病毒與宿主細胞結(jié)合和融合中發(fā)揮不可替代的作用,本研究的第一部分擬通過對來源于2例ADC病人各6個組織的共60株HIV-1gp120序列進行基因多樣性與生物學活性位點分析,對HIV-1gp

2、120基因多樣性和生物學活性與ADC發(fā)病的關系作出初步判斷。
　　 HIV-1致ADC發(fā)病的機制尚不清楚,但可以肯定的是它可以通過刺激膠質(zhì)細胞或巨噬細胞分泌細胞因子TNF-α、IL-1β引起神經(jīng)元細胞損傷。鑒于HIV-1病毒載量與ADC的發(fā)生并非總是有關,本研究的第二部分擬通過分析不同病人不同組織來源基因不完全相同的HIV-1gp120誘導細胞分泌TNF-α、IL-1β的能力,來探討HIV-1gp120基因差異是否與其刺激細胞分

3、泌TNF-α、IL-1β的能力有關,從而為ADC闡述發(fā)病機制提出新觀點,為ADC的預防與控制提供新思路。
　　 方法
　　 1.以HIV-1B標準株HXB2 gp120基因序列基因組DNA序列作為模板,應用Primer5.0軟件設計引物,巢式PCR法擴增源自兩例ADC病人共12個不同組織的HIV-1gp120序列,PCR產(chǎn)物經(jīng)TA克隆后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,經(jīng)藍白斑、氨芐青霉素篩選及測序后,每個部位選取5個HIV-1

4、gp120陽性克隆進行序列分析。通過對來自于兩例ADC病人不同組織的HIV-1gp120序列分別進行系統(tǒng)發(fā)育樹、ds/dn比值、糖基化位點、V3環(huán)關鍵位點氨基酸等分析,以探討HIV-1gp120與ADC發(fā)病的關系。
　　 2.隨機選取源自兩例ADC病人外周組織、中樞神經(jīng)組織的HIV-1gp120克隆各一個(共4個克隆),PCR擴增gp120基因,經(jīng)TA克隆、藍白斑及氨芐青霉素篩選,提取陽性質(zhì)粒,雙酶切后的gp120片段與經(jīng)過同樣

5、雙酶切的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體.MSCV-IRES-GFP連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,氨芐青霉素篩選HIV-1gp120陽性表達載體,經(jīng)雙酶切和測序證實。然后將逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體與pUMVC、pCMV-VSV-G共轉(zhuǎn)染293T細胞,免疫熒光顯微鏡觀察逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的表達、免疫組化實驗檢測HW-1gp120的表達。收獲免疫熒光檢測陽性的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒懸液,經(jīng)逐孔稀釋法測定其感染滴度,然后感染U87細胞,熒光顯微鏡檢測重組逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白的表達,

6、免疫組化實驗檢測HIV-1gp120的表達,ELISA法測定細胞上清中TNF-α、IL-1β的含量,SPSS軟件分析測定結(jié)果。
　　 結(jié)果
　　 1.獲得了來源于兩例ADC病人各6個組織共60個HIV-1gp120陽性克隆,并經(jīng)測序證實,BLAST分析均為HIV-1Bgp120序列。
　　 2.構建了每例ADC病人來源的各6個組織共30個HIV-1gp120基因克隆的系統(tǒng)發(fā)育樹,由系統(tǒng)發(fā)育樹可見,不同組織來源的H

7、W-1gp120基因位于不同的系統(tǒng)發(fā)育樹進化枝上,不同組織來源的HIV-1gp120基因克隆也可以存在交叉現(xiàn)象。
　　 3.與HIV-1B標準株HXB2 gp120相比,第一例ADC病人來源的HIV-1gp120其各自的ds/dn=1.1744±0.0348(p＜0.001);第二例病人體內(nèi)來源的所有HIV-1gp120基因序列的ds/(dn=0.8222±0.2086(p＜0.001);兩個病例來源的HIV-1gp120基因序

8、列的ds/dn具有顯著性差別(p＜0.001)。
　　 4.以HIV-1B標準株HXB2gp120的糖基化位點為標準,第一例ADC病人來源HIV-1gp120序列糖基化位點相對比較保守,第二例ADC病人來源的HIV-1gp20序列糖基化位點變異較大。
　　 5.根據(jù)現(xiàn)有的資料,可以預測感染兩例ADC病人大腦組織的HIV-1病毒均為CCR5受體使用型、巨噬細胞嗜性、非合胞體誘導型毒株。
　　 6.構建了4個HW-1

9、包膜糖蛋白gp120的逆轉(zhuǎn)錄表達載體A1/MIG、B1/MIG、A2/MIG、B2/MIG,雙酶切鑒定目的片段和載體分別為1.44kb和6.8kb,并經(jīng)測序證實。對四個表達載體中的HIV-1gp120進行分析,發(fā)現(xiàn)四株HW-1gp120序列存在基因差異,其中A1/MIG的V3環(huán)序列與其他三株序列差異較大。
　　 7.熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染MSCV-IRES-GFP、pUMVC及pCMV-VSV-G的293T細胞及感染重組逆

10、轉(zhuǎn)錄病毒的U87細胞中均有綠色熒光信號產(chǎn)生。逐孔稀釋法測定重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的滴度約為106/ml。
　　 8免疫組化實驗顯示轉(zhuǎn)染A1/MIG、B1/MIG、A2/MIG、B2/MIG表達載體的293T細胞及感染HIV-1gp120陽性重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的U87細胞中均有HW-1gp120陽性細胞出現(xiàn)。
　　 9.ELISA測定重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞上清中TNF-α、IL-1β含量,發(fā)現(xiàn)HIV-1gp120陽性重組逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導

11、細胞分泌的TNF-α、IL-1β量高于HIV-1gp120陰性重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(p＜0.001);第一例ADC病人外周組織來源的HIV-1gp120誘導細胞分泌TNF-α、IL-1β的量高于其它3個組織來源的HIV-1gp120(p＜0.001),而其他3個組織來源的HIV-1gp120誘導分泌的TNF-α、IL-1β的量差別無統(tǒng)計學意義(p＞0.10)。
　　 結(jié)論
　　 1.HIV-1 gp120的基因多樣性和生物學活