轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型的構(gòu)建及其在致癌活性檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、為了滿足日益增多的化學(xué)物質(zhì)致癌活性檢測(cè)的需要，本研究擬建立惡性轉(zhuǎn)化前的非轉(zhuǎn)化人細(xì)胞株并探討其致癌活性檢測(cè)的可行性，目的在于完善目前所采用的體外代謝系統(tǒng)，建立穩(wěn)定的、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的細(xì)胞檢測(cè)模型。 研究?jī)?nèi)容及方法： 1.細(xì)胞模型的構(gòu)建 1.1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型的構(gòu)建 利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法于永生化人支氣管上皮細(xì)胞16HBE中導(dǎo)入人端粒酶催化亞基hTERT或空白載體，通過端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法檢測(cè)端

2、粒酶的活性；用P450-GLOTM檢測(cè)CYP1A1酶活性。 1.2DNA修復(fù)基因缺陷細(xì)胞的構(gòu)建 利用慢病毒載體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，把4種DNA修復(fù)基因共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因、切除交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因1、切除交錯(cuò)互補(bǔ)修復(fù)基因2、錯(cuò)配修復(fù)基因的短發(fā)夾雙鏈RNA載體導(dǎo)入永生化人胚腎上皮細(xì)胞株，并設(shè)立靶向干擾熒光蛋白的shRNA載體作為對(duì)照。嘌呤霉素篩選后分別命名HEK-shATM，HEK-shERCC1，HEK-shERC

3、C2，HEK-shMLH1和HEK-shGFP。RT-PCR驗(yàn)證DNA修復(fù)基因沉默細(xì)胞株ATM、ERCC1、ERCC2、MLH1mRNA的表達(dá)。 2.細(xì)胞生物學(xué)特性觀察 通過對(duì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察、生長(zhǎng)曲線、倍增時(shí)間、染色體畸變、軟瓊脂克隆形成情況及裸鼠皮下成瘤情況，觀察轉(zhuǎn)基因及修復(fù)基因沉默對(duì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。以DNA修復(fù)基因沉默細(xì)胞為靶細(xì)胞，1.0μg/ml絲裂霉素MMC染毒，觀察DNA修復(fù)基因沉默細(xì)胞對(duì)MMC遺傳損傷

4、的敏感性。 3.環(huán)氧二醇苯并芘、硫酸鎳、甲硝基亞硝胍、佛波酯誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 首先用臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞毒性，根據(jù)細(xì)胞存活率計(jì)算半數(shù)致死濃度，選擇LC50的30％作為染毒的最高劑量。BPDE、NiSO4、MNNG作用于16HBE細(xì)胞的LC50分別是4.5μM、774μM、15μM。DMSO作為溶劑對(duì)照組。以轉(zhuǎn)化細(xì)胞HEKTRST作為陽(yáng)性對(duì)照。將細(xì)胞消化后按5×104個(gè)每孔的密度接種到6孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)平行樣。染毒24

5、小時(shí)后棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)基。每周染毒一次，共4次。于初次染毒后第5周開始，每3周將染毒后的細(xì)胞接種到軟瓊脂，將能夠連續(xù)兩周在軟瓊脂中形成克隆的細(xì)胞接種到裸鼠皮下驗(yàn)證其惡性轉(zhuǎn)化表型。觀察各轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型及DNA修復(fù)基因沉默細(xì)胞模型對(duì)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的敏感性。 4.B(a)P的代謝活化及誘導(dǎo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 采用3種方式代謝活化B(a)P：加入S9-mix、過度表達(dá)CYP1A1、染毒前用1μM低劑量B(a)P誘導(dǎo)HBETR細(xì)胞

6、48小時(shí)。計(jì)算加入S9-mix或未加入S9-mix下B(a)P作用于HBE細(xì)胞的LC50，分別足10μM和80μM。加入S9-mix時(shí)B(a)P染毒濃度是0.1μM、0.5μM和1μM，染毒6個(gè)小時(shí)；HBETR-1A1和HBETR-IN細(xì)胞的染毒濃度5μM、10μM和20μM，染毒24小時(shí)。細(xì)胞消化后按5×104個(gè)每孔的密度接種到6孔培養(yǎng)板，設(shè)3個(gè)平行樣，染毒24小時(shí)棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)基。每周染毒一次，共4次。于第5周進(jìn)行軟瓊脂實(shí)驗(yàn)

7、及裸鼠皮下成瘤試驗(yàn)，每3周進(jìn)行一次，觀察3種方式代謝活化B(a)P和誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力。 結(jié)果： 1.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型及DNA修復(fù)基因缺陷細(xì)胞模型的建立 RT-PCR檢出HBET細(xì)胞hTERTmRNA表達(dá)，蛋白印跡法驗(yàn)證了HBET細(xì)胞HA的表達(dá)，端粒酶活性檢測(cè)表明HBET細(xì)胞中端粒酶活性明顯增高；蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，癌基因H-Ras，c-Myc及猿猴病毒SV40ST的蛋白表達(dá)升高；RT-PCR驗(yàn)證HBETR-1A

8、1細(xì)胞CYP1A1mRNA的表達(dá)，蛋白印跡結(jié)果表明HBETR-1A1細(xì)胞CYP1A1蛋白的表達(dá)是對(duì)照HBETR-V細(xì)胞的2.7倍，酶活性的檢測(cè)結(jié)果表明HBETR-1A1細(xì)胞CYP1A1酶活性是對(duì)照HBETR-V細(xì)胞的5.5倍；HBETFRST和HBETMST細(xì)胞于熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)約80％細(xì)胞表達(dá)熒光，表明轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株HBET、HBETM、HBETR、HBETR-1A1、HBETRST、HBETMST構(gòu)建成功。從RT-PCR的結(jié)果可見，各

9、修復(fù)基因ATM、ERCC1、ERCC2、MLH1均有不同程度的抑制，表明幾種修復(fù)基因沉默細(xì)胞構(gòu)建成功。 2.細(xì)胞的生物學(xué)特性 2.1細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特性的觀察 hTERT、癌基因H-Ras、c-Myc及CYP1A1的表達(dá)未使細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生明顯改變，但SV40ST的導(dǎo)入使細(xì)胞體積增大，細(xì)胞失去接觸抑制，呈重疊生長(zhǎng)。端粒酶催化亞基hTERT的導(dǎo)入使細(xì)胞的增殖速度明顯加快，而癌基因H-Ras、c-Myc和SV40ST

10、的導(dǎo)入進(jìn)一步加快細(xì)胞的增殖速度。 2.2染色體畸變分析 在計(jì)數(shù)的100個(gè)中期相細(xì)胞中，染色體畸變以染色體數(shù)目異常為主，偶見染色單體斷裂的結(jié)構(gòu)異常,差異無顯著性，提示癌基因的導(dǎo)入未引起細(xì)胞染色體畸變率明顯的改變。 2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性檢測(cè) 把上述構(gòu)建的幾種細(xì)胞接種在軟瓊脂中，觀察細(xì)胞形成克隆的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了HBETMST和HBETRST兩株細(xì)胞在軟瓊脂中形成大量的克隆，其它幾株細(xì)胞HBET、HBETM、H

11、BETR和HBETR-1A1未見克隆生長(zhǎng)。將HBETMST和HBETRST兩株細(xì)胞接種于裸鼠皮下，接種后13天形成肉眼可見的腫瘤，而其它細(xì)胞均不能在裸鼠皮下形成腫瘤。結(jié)果表明細(xì)胞在永生化基礎(chǔ)上表達(dá)癌基因H-Ras或c-Myc，不足以使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，但是SV40ST的導(dǎo)入最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。 2.4DNA修復(fù)基因沉默影響 絲裂霉素C誘導(dǎo)的DNA損傷效應(yīng)DNA修復(fù)基因沉默細(xì)胞HEK-shATM、HEK-shERCC

12、1、HEK-shERCC2、HEK-shMLH1在細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)速度以及染色體畸變率方面沒有差別，細(xì)胞均未能在軟瓊脂中形成克隆和在裸鼠皮下成瘤，提示DNA修復(fù)基因ATM、ERCC1、ERCC2、MLH1的沉默并沒有影響細(xì)胞的生物學(xué)特性。 MMC作用后各細(xì)胞株微核率均于染毒后24h達(dá)到高峰，與對(duì)照相比差異有顯著性；MMC于染毒24小時(shí)撤掉后對(duì)各細(xì)胞株的微核率下降過程的動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組在染毒后的60h，微核率基本下降至正常，表明

13、DNA修復(fù)基因ERCC2、ATM的沉默使細(xì)胞對(duì)化學(xué)物質(zhì)作用的敏感性增高。 3.BPDE、NiSO4、MNNG、TPA誘導(dǎo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 3.1HBETR、HBETM、HBETV細(xì)胞轉(zhuǎn)化敏感性的比較 HBETR、HBETM、HBETV細(xì)胞在軟瓊脂中的克隆形成數(shù)與染毒劑量之間存在著劑量-反應(yīng)關(guān)系。提示癌基因H-Ras和c-Myc高表達(dá)可縮短細(xì)胞轉(zhuǎn)化的間期，提高細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率，H-RasVI2高表達(dá)較c-Myc更為敏感。

14、 3.2HBETR和HEKTR細(xì)胞轉(zhuǎn)化敏感性的比較 HBETR與HEKTR細(xì)胞相比，在BPDE、NiSO4、TPA、MNNG誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中較HEKTR細(xì)胞敏感，轉(zhuǎn)化間期較HEKTR細(xì)胞縮短4-6周。雖然兩種細(xì)胞對(duì)MNNG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的敏感性一樣，但發(fā)現(xiàn)HBETR細(xì)胞克隆形成率較HEKTR細(xì)胞高。提示致癌物誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化具有靶細(xì)胞特異性。 3.3NiSO4、MNNG、TPA誘導(dǎo)DNA修復(fù)基因沉默細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

15、DNA修復(fù)基因沉默細(xì)胞HEK-shATM、HEK-shERCC1、HEK-shERCC2、HEK-shMLH1在NiSO4、MNNG、TPA作用下，觀察20周均未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。提示幾種DNA修復(fù)基因沉默細(xì)胞對(duì)NiSO4、MNNG、TPA誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化不敏感。 4.B(a)P的代謝活化及誘導(dǎo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 采用3種方式代謝活化B(a)P：加入S9-mix、過度表達(dá)CYP1A1、染毒前用1μM低劑量B(a)P誘導(dǎo)HBETR細(xì)

16、胞48小時(shí)(HBETR-IN)。結(jié)果與酶活性及蛋白表達(dá)水平相一致。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了癌基因H-RasVI2和癌基因c-Myc高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，所構(gòu)建的細(xì)胞株生長(zhǎng)速度加快，但生長(zhǎng)形態(tài)、染色體畸變、錨著獨(dú)立性生長(zhǎng)等生物學(xué)特性無明顯改變，未能獲得惡性轉(zhuǎn)化的表型。在高表達(dá)H-Ras和c-Myc的基礎(chǔ)上繼續(xù)導(dǎo)入SV40ST能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。 2.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)成功構(gòu)建了DNA修復(fù)基因ATM、ERCC1、

17、ERCC2、MLH1沉默細(xì)胞株，所構(gòu)建的細(xì)胞株在生長(zhǎng)形態(tài)、生長(zhǎng)速度、染色體畸變、錨著獨(dú)立性生長(zhǎng)等生物學(xué)特性無明顯改變，未能獲得惡性轉(zhuǎn)化的表型。其中ATM和ERCC2基因沉默細(xì)胞對(duì)絲裂霉素C誘導(dǎo)的DNA損傷作用敏感性增高。DNA修復(fù)基因沉默細(xì)胞模型對(duì)致癌物誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化不敏感。 3.H-RasVI2和癌基因c-Myc高表達(dá)可縮短細(xì)胞轉(zhuǎn)化的間期，提高細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率，H-RasVI2高表達(dá)較c-Myc更為敏感。致癌物誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化具有靶