轉(zhuǎn)基因小鼠模型的載體構(gòu)建和在人肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的：構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型的載體，檢測載體表達(dá)盒的可行性，所攜帶fat-1基因在真核細(xì)胞（人肝癌HepG2細(xì)胞）的表達(dá)、以及功能發(fā)揮情況（對細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞周期中所起的作用），鑒定出轉(zhuǎn)基因小鼠載體的合適性。 方法：將n-3多不飽和脂肪酸脫氫酶基因fat-1的cDNA插入到真核表達(dá)載體(pcDNA3.1(+)myc-His A)中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)Inyc-His A-fat-1，用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染到

2、人肝癌HepG2細(xì)胞中，RT-PCR檢測fat-1基因的表達(dá)，MTT法分析fat-1基因?qū)epG2細(xì)胞增殖的影響，氣相色譜分析檢測fat-1基因?qū)epG2細(xì)胞n-6/n-3多聚不飽和脂肪酸(PUFAs)比例的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測fat-1基因?qū)epG2細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果：成功地構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)nyc-His A-fat-1，所攜帶的fat-1基因能在HepG2細(xì)胞內(nèi)有效異源表達(dá)，48h

3、后可檢測到fat-1 mRMA的條帶。與對照細(xì)胞相比，fat-1基因有效地抑制了人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的增殖(70％，p<0.01)，促進(jìn)了凋亡，細(xì)胞增殖主要被阻滯在G0/G1期；同時降低了人肝癌細(xì)胞n-6/ n-3 PUFAs比例。這說明fatl基因很好地發(fā)揮了功能。 結(jié)論：所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)myc-His A-fat-1可以作為真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)。所攜帶的fat-1基因功能發(fā)揮正常：能降低人肝癌He