基質(zhì)金屬蛋白酶-26在非小細胞肺癌中的表達、臨床意義及調(diào)控機制.pdf

1、肺癌是當(dāng)前人類發(fā)病率最高的惡性腫瘤，肺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移是其惡性標(biāo)志和特征，也是造成病人死亡的主要原因。而基底膜和細胞外基質(zhì)（主要成分是Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白等）的降解和破壞是腫瘤轉(zhuǎn)移多階段過程中的重要步驟。多種蛋白酶家族如基質(zhì)金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶等可能促進各種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是其中最主要的酶家族。MMPs是一組金屬離子鋅依賴的、能

2、降解細胞外基質(zhì)的高度保守蛋白水解酶家族，迄今為止，人類中已識別和定性的有23種。根據(jù)作用底物的特異性，MMPs家族可分為膠原酶（MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18），明膠酶（MMP-2、MMP-9），間質(zhì)溶解素（MMP-3、MMP-10、MMP-11）、基質(zhì)溶解因子（MMP-7、-26），膜接合型（MT）-MMPs（MMP-14、-15、-16、-24、MMP-17、-25）和其他型（MMP-12、-19.-20、-21

3、、-23、-27、-28）。 基質(zhì)金屬蛋白酶-26（MMP-26），又稱基質(zhì)溶解因子-2（matrilysin-2或endometase），是MMPs家族基質(zhì)溶解因子亞組的新成員，新近從人子宮內(nèi)膜癌細胞系cDNA文庫克隆，呈現(xiàn)一系列不同于MMPs家族其它成員的結(jié)構(gòu)和功能特性。MMP-26可有效裂解纖維蛋白原和ECM蛋白，包括纖維連接蛋白、玻璃體結(jié)合蛋白、變性膠原、α1-抗胰蛋白酶，表明其在腫瘤侵襲和血管發(fā)生方面有重要而獨特的功能

4、。 目前已有研究表明，MMP-26在正常組織的表達具有組織特異性，MMP-26在不同癌的表達趨勢不同，而已有的研究表明腫瘤相關(guān)因子刺激下可促進MMP-26、TIMP-4轉(zhuǎn)錄激活，因而我們推測p38MAPK、ERK與MMP-26之間可能存在相互作用。關(guān)于MMP-26在癌侵襲轉(zhuǎn)移的可能機制，現(xiàn)有幾個研究發(fā)現(xiàn)MMP-26可能主要是通過激活MMP-9，改變TIMP-4表達等促進癌細胞的侵襲能力。目前關(guān)于MMP-26有限的研究主要集中在前

5、列腺、子宮、乳腺、食管癌，然而不同癌結(jié)果相異，作用機制也不很清楚，尚無MMP-26與肺癌相關(guān)性的系統(tǒng)研究。本研究擬探討：1、MMP-26在非小細胞肺癌組織的表達與臨床病理相關(guān)性；2、MAPK信號通路阻滯劑對肺癌細胞MMP-26蛋白表達的影響；3、肺癌細胞轉(zhuǎn)染含MMP-26cDNA質(zhì)粒及針對MMP-26mRNA的干擾質(zhì)粒shRNA后MMP-26、MMP-9、TIMP-4基因、蛋白、細胞侵襲能力變化及MMP-26、MMP-9在細胞內(nèi)定位情況

6、。通過上述多個層面研究，探討MMP-26在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制以及作為靶點進行干預(yù)的可能性。 實驗分三部分： 第一部分：MMP-26蛋白在非小細胞肺癌的表達及意義。 目的：檢測MMP-26蛋白在侵潤性非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）、侵潤前肺癌和正常肺組織中的表達，探討MMP-26在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用及與預(yù)后的關(guān)系。 方法：采用免疫組織化學(xué)（SP

7、）法，分別檢測72例NSCLC、14例非典型增生和10例正常肺組織中MMP-26蛋白的表達。 結(jié)果：正常肺組織MMP-26蛋白高表達率0（0/10），非典型增生高表達率14.3％（2/14），NSCLC高表達率59.7％（43/72）。MMP-26蛋白在NSCLC中的表達高于非典型增生及正常肺組織（P<0.01），非典型增生MMP-26蛋白表達高于正常肺組織表達，但二者差異無顯著性（P>0.05）。MMP-26蛋白表達與分期（P

8、<0.05）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），而與患者年齡、性別以及腫瘤大小、分化無關(guān)（均為P>0.05）。Cox比例風(fēng)險模型進行多因素生存分析顯示：MMP-26與臨床分期是有意義的預(yù)后指標(biāo)（P<0.05）。MMP-26蛋白高表達的NSCLC患者無復(fù)發(fā)生存期和總生存期低于陰性表達的患者（分別為log-rank=19.34、23.2，P<0.001、0.001）。 結(jié)論：MMP-26蛋白高表達與NSCLC發(fā)生、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期

9、及預(yù)后有關(guān)，有可能作為判斷NSCLC進展和預(yù)測預(yù)后的一種指標(biāo)。 第二部分：ERK信號通路與MMP-26在肺腺癌表達的關(guān)系。 目的：研究細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracelluar signal-regulated kinase，ERK）通路與基質(zhì)金屬蛋白酶-26（matrix metalloproteinase-26，MMP-26）在肺腺癌表達的相關(guān)性及意義。 方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)（SP）法檢測pERK、pp3

10、8MAPK及MMP-26在44例肺腺癌組織中的表達。Western blot檢測U0126阻斷ERK信號通路后肺腺癌A549細胞MMP-26蛋白表達水平的變化。分析pERK和MMP-26表達與肺腺癌預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果：pERK、pp38MAPK及MMP-26蛋白在肺腺癌組織中高表達率分別為59.1％、20.4％、54.5％，pERK與MMP-26表達存在正相關(guān)（r=0.63，P<0.05），并與肺腺癌的臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移狀況相關(guān)

11、（P<0.05），而與患者年齡、腫瘤大小無明顯相關(guān)性（P>0.05）。pp38MAPK與MMP-26、患者年齡、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、臨床分期均無明顯相關(guān)性（P>0.05）。用ERK阻斷劑U0126阻斷ERK信號通路可降低MMP-26蛋白表達水平，并且隨U0126濃度升高MMP-26蛋白表達水平逐漸降低。肺腺癌組織pERK、MMP-26蛋白的表達與腫瘤的預(yù)后顯著相關(guān)（分別為log-rank=5.52、7.01，P=0.019、0.008）

12、。 結(jié)論：ERK信號通路可能通過上調(diào)MMP-26的表達促進肺腺癌的惡性進展，ERK信號通路可能是肺腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的重要途徑，pERK和MMP-26的表達可輔助用于肺腺癌的預(yù)后評估，為ERK信號通路作為肺腺癌治療的靶點提供理論依據(jù)。 第三部分：MMP-26 cDNA表達質(zhì)粒和針對MMP-26 mRNA的shRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及其對肺癌細胞生物學(xué)特性的影響。 目的：構(gòu)建含MMP-26 cDNA的表達質(zhì)粒，構(gòu)建含針對

13、MMP-26mRNA的shRNA干擾質(zhì)粒，觀察轉(zhuǎn)染上述質(zhì)粒對細胞生物學(xué)特性的影響。 方法：構(gòu)建含MMP-26 cDNA的表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染到MMP-26低表達的95-C細胞，并篩選穩(wěn)定表達的含MMP-26 cDNA的細胞，Western blot檢測MMP-26、MMP-9、TIMP-4蛋白表達，RT-PCR檢測MMP-26mRNA、MMP-9mRNA、TIMP-4mRNA表達，明膠酶譜分析檢測過表達MMP-26對95-C分泌MMP

14、-9的影響，Transwell試驗檢測細胞體外侵襲力，雙熒光免疫細胞化學(xué)染色檢測MMP-26、MMP-9蛋白在細胞內(nèi)定位。 構(gòu)建含針對MMP-26 mRNA的shRNA干擾質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染高表達MMP-26的A549細胞，并篩選穩(wěn)定表達的含MMP-26 shRNA的細胞，Western blot檢測MMP-26、MMP-9、TIMP-4蛋白表達，RT-PCR檢測MMP-26mRNA、MMP-9mRNA、TIMP-4 mRNA表達，明膠

15、酶譜分析檢測過表達MMP-26對A549細胞分泌MMP-9的影響，Transwell試驗檢測細胞體外侵襲力。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染含MMP-26 cDNA表達質(zhì)粒的95-C細胞MMP-26、MMP-9蛋白表達上調(diào)（p<0.05），TIMP-4下調(diào)（p<0.05）；MMP-26mRNA、MMP-9mRNA表達上調(diào)（p<0.05），TIMP-4mRNA表達下調(diào)p<0.05）。明膠酶譜分析顯示過表達MMP-26的95-C分泌MMP-9能力明顯增

16、強（p<0.05），體外侵襲力增強（p<0.05），雙熒光免疫細胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)MMP-26、MMP-9在細胞內(nèi)共定位。 轉(zhuǎn)染針對MMP-26 mRNA的shRNA干擾質(zhì)粒的A549細胞MMP-26、MMP-9蛋白表達下調(diào)（p<0.05），TIMP-4蛋白上調(diào)（p<0.05），MMP-26mRNA、MMP-9mRNA表達下調(diào)（p<0.05），TIMP-4 mRNA上調(diào)（p<0.05），分泌MMP-9能力明顯下降（p<0.05），體