基質(zhì)金屬蛋白酶家族及西洛他唑在NSTEMI中的臨床意義及其分子機制研究.pdf

1、背景：
　　冠心?。╟oronaryheartdisease，CHD）的發(fā)病率在當今世界上占首要地位，該病一旦發(fā)展成心肌梗塞、心力衰竭，則病人生活質(zhì)量下降，甚至喪失勞動力，給國家造成重大負擔(dān)。非ST段抬高型心肌梗死（Non-STelevationmyocardialinfarction，NSTEMI)是CHD患者嚴重類型之一，常見于高齡、女性、高血壓以及糖尿病患者。研究表明與藥物保守治療相比，經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutan

2、eouscoronaryintervention，PCI）NSTEMI有利于降低患者的死亡率，改善NSTEMI患者的臨床預(yù)后。但這些臨床實驗結(jié)論均是基于對NSTEMI患者要在適當?shù)臅r機行PCI治療，而不同的臨床試驗中，關(guān)于“適當?shù)臅r機”的具體時間差異很大。因此，NSTEMI患者發(fā)病后何時采用PCI治療才能使NSTEMI患者獲得最大益處仍是一個尚待解決的問題。
　　心肌缺血是CHD的發(fā)病重要的起因之一。近十年來，CHD的病理生理學(xué)有

3、了長足的發(fā)展，多數(shù)學(xué)者認為冠狀動脈硬化性心臟病是造成缺血性心臟病最常見的病因[1]。心肌缺血的基本矛盾是心肌細胞對氧的供需失調(diào)及心肌細胞代謝產(chǎn)物清除不良所致。然而心肌缺氧所致心肌損傷的發(fā)生機制尚未完全闡明[2]。近年來一些研究發(fā)現(xiàn)心肌細胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）與心肌細胞缺氧損傷密切相關(guān)，因此ECM在CHD發(fā)生過程中起重要作用[3]，治療CHD有效的藥必須同時考慮到逆轉(zhuǎn)左心室重構(gòu)[2]。
　　西洛他

4、唑是一種磷酸二酯酶III型抑制劑，通過抑制磷酸二酯酶的活性抑制血小板聚集和擴張血管的效應(yīng)。近年研究發(fā)現(xiàn)西洛他唑還可以抑制炎癥因子誘導(dǎo)的核因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)的激活，抑制血管細胞粘附分子-1（VascularCellAdhesionMolecule-1，VCAM-1）和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMPs），尤其是MMP-9的表達，改善氧化應(yīng)激引起的內(nèi)皮細胞（end

5、othelialcells，ECs）衰老、TNF-a及超氧化物的形成。上述研究提示西洛他唑表現(xiàn)出不單具有抗血小板聚集作用的多效性，但西洛他唑是否影響NSTEMI患者的左心室重構(gòu)及心功能尚無定論。
　　多數(shù)心肌梗死（myocardialinfarction，MI）是由于冠狀動脈管腔內(nèi)動脈粥樣硬化（artherosclerosis，AS）斑塊破裂導(dǎo)致急性血栓形成。斑塊破裂后暴露的脂質(zhì)核心中的巨噬細胞被激活，分泌組織因子，促使血小板在破

6、裂處發(fā)生聚集，形成堵塞冠狀動脈管腔的血栓。AS斑塊主要由富含脂質(zhì)的粥樣物質(zhì)與覆蓋其上的纖維帽組成，纖維帽厚度在穩(wěn)定AS斑塊中發(fā)揮重要作用。易損斑塊的破裂是引起MI的主要原因，而在AS斑塊破裂時炎癥參與了斑塊的破裂過程，表現(xiàn)在外周血中的C-反應(yīng)蛋白（C-reactiveprotein，CRP）、纖維蛋白原和相關(guān)的致炎因子的濃度明顯升高。在AS斑塊失穩(wěn)定的過程中，炎癥可以激活單核源性的巨噬細胞合成和分泌MMPs，MMPs可以降解AS斑塊中的

7、ECM。越來越多的證據(jù)表明，MMPs在AS斑塊失穩(wěn)定的過程中起重要作用。
　　左心室重構(gòu)是AMI后常見的病理生理過程，左心室舒張末期容積（leftventricularend-diastolicvolume，LVEDV）和左心室射血分數(shù)（Leftentricularejectionfraction，LVEF）是反映左心室重構(gòu)的重要指標。MMPs參與的膠原基質(zhì)降解是AMI后左心室重構(gòu)的重要機制。
　　本課題將探討對NSTEMI

8、患者采用不同時機（早期或延遲）介入治療以及是否合用西洛他唑?qū)STEMI患者左心室重構(gòu)及左心室功能的影響；同時研究NSTEMI患者血漿中MMP-2和MMP-9能否成為左心室重構(gòu)及左心室功能障礙的預(yù)測因子；此外從細胞分子水平闡明西洛他唑?qū)Ω纳菩募∪毖跛滦募p傷的藥理機制，為臨床應(yīng)用西洛他唑藥物提供實驗依據(jù)。
　　目的：
　　1、明確NSTEMI患者血漿中MMPs、組織金屬蛋白酶抑制劑-1（tissueinhibitorsof

9、metalloproteinases，TIMP-1）及相關(guān)炎癥因子濃度的變化，分析MMPs與部分炎癥因子間關(guān)系；
　　2、探討NSTEMI后MMPs時間變化規(guī)律及其對NSTEMI后左心室重構(gòu)的預(yù)測效果；
　　3、研究NSTEMI的早期或延遲介入治療和西洛他唑?qū)ψ笮氖抑貥?gòu)及左心功能的影響；
　　4、觀察缺氧誘導(dǎo)后不同時期、不同程度心肌細胞凋亡時MMPs活性水平的動態(tài)變化；
　　5、探討西洛他唑干預(yù)缺氧誘導(dǎo)培養(yǎng)的心肌

10、細胞凋亡機制；
　　方法：
　　1、試驗對象的選取：試驗一連續(xù)入選NSTEMI、不穩(wěn)定型心絞痛（unstableanginapectoris，UAP）和穩(wěn)定型心絞痛（stableanginapectoris，SAP）患者各30名，分別于入院即刻抽取外周靜脈血。另取30名健康成人血液標本做為對照組，酶聯(lián)免疫吸附分析（enzymelinkedimmunesorbentassay，ELISA）檢測血漿中MMP-1，MMP-2、MM

11、P-9、TIMP-1、白介素-6（interieukin-6，IL-6）、高敏C-反應(yīng)蛋白（high-sensitivityC-reactiveprotein，hs-CRP）和TNF-α的濃度。分析MMP-2、MMP-9、TIMP-1、IL-6與hs-CRP的相互關(guān)系。
　　試驗二連續(xù)入選符合入選標準，無排除條件并行PCI的NSTEMI患者74名，隨機分為早期PCI組（發(fā)病24h內(nèi)完成PCI）及延遲PCI組（發(fā)病36h后任何時間完

12、成PCI）。兩組患者根據(jù)是否給予西洛他唑治療再次分為西洛他唑治療組及非西洛他唑治療組。PCI術(shù)前及術(shù)后即刻抽取血液，分析術(shù)前及術(shù)后血漿中MMP-2、MMP-9及hs-CRP的濃度變化。PCI術(shù)前常規(guī)給予氯吡格雷及阿司匹林，西洛他唑組給予西洛他唑100mg，2/日口服，連續(xù)應(yīng)用6個月。
　　2、入選的NSTEMI患者PCI術(shù)后臨床隨訪6個月，對比術(shù)前及術(shù)后6個月心臟超聲圖，分析各組LVEDV的變化和LVEF。研究NSTEMI介入治療

13、時機及西洛他唑治療對左心室重構(gòu)的影響。
　　3、各組NSTEMI患者分別于MI發(fā)病后2天、4天、7天、4周抽取外周靜脈血，ELISA檢測MMP-2、MMP-9的濃度。分析MMP-2和MMP-9在MI后的表達情況及不同處理方式對其濃度的影響。探討不同時間點MMP-2、MMP-9濃度與LVEDV變化及LVEF的相關(guān)關(guān)系。
　　4、本實驗以乳鼠心肌細胞作為研究對象，采用AnnexinV/PI雙染細胞檢測方法測定凋亡心肌細胞,明膠酶

14、譜分析檢測細胞凋亡過程中MMP-2的活性變化，Westernblot方法檢測細胞凋亡過程中MMP-2、NF-κB和P53蛋白的表達，通過阻斷抑制TNF-а和MMP-2實驗，觀察缺氧對心肌細胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)，檢測不同濃度西洛他唑?qū)θ毖鹾蟛煌瑫r期的心肌細胞凋亡水平變化，并初步分析其變化的可能機制。
　　5、統(tǒng)計學(xué)處理
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以-x±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比

15、較采用LSD檢驗，處理組同對照組間的多重比較采用Dunnett法；兩組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗；兩變量之間關(guān)系分析采用雙變量相關(guān)分析；P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異非常顯著。
　　結(jié)果：
　　1、入選試驗一的各組患者一般情況
　　同對照組和SAP組相比，白細胞計數(shù)在UAP組和NSTEMI組的患者中顯著性升高（P<0.01），但白細胞計數(shù)在UAP組和NSTEMI組無顯著性差異(P>0.05)；各組在年齡

16、、性別構(gòu)成、吸煙、伴隨疾病、血脂等方面，差異無顯著性(P>0.05)。
　　2、MMPs及部分炎癥因子在NSTEMI中的表達
　　與對照組和SAP組相比，MMP-1、MMP-2、MMP-9，TIMP-1，TNF-a，hs-CRP和IL-6濃度在UAP組和NSTEMI組患者血漿中升高并具有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）。同UAP組相比，NSTEMI組患者血漿中MMP-1、-9，TIMP-1和TNF-a，Hs-CRP和

17、IL-6濃度顯著升高（P<0.05或P<0.01）。MMP-2的濃度在UAP組和NSTEMI組差異無顯著性（P=0.077）。
　　在NSTEMI患者中，發(fā)病時MMP-2，MMP-9，TIMP-1和IL-6的濃度改變與hs-CRP濃度改變明顯相關(guān)（分別為r=0.316，P=0.012；r=0.862，P=0.000；r=0.375，P=0.041和r=0.583，P=0.001）。而其中MMP-9的濃度改變與hs-CRP的濃度改變

18、相關(guān)性最強。
　　3、試驗二入選患者一般情況及隨訪6個月主要不良事件發(fā)生率
　　各組患者在年齡、性別構(gòu)成、吸煙、伴隨疾病、血脂、白細胞計數(shù)、入院前服用藥物情況等方面，均無顯著差異(P>0.05)。PCI術(shù)后隨訪6個月期間，各組在死亡率、因MI再入院率、心衰發(fā)生率等不良事件發(fā)生方面無顯著差異(P>0.05)。
　　4、PCI術(shù)對MMPs及hs-CRP的影響
　　同術(shù)前相比，PCI術(shù)后MMP-2，MMP-9及hs-C

19、RP的濃度在早期PCI組和延遲PCI組均顯著性升高(P<0.05或P<0.01)。
　　5、MI后MMP-2，-9的變化
　　同MI后2天相比，各組MI后4天、7天、4周血漿中的MMP-2濃度顯著性升高（P<0.01）。同MI后4天、7天相比，各組MI后4周血漿中的MMP-2濃度顯著性升高（P<0.05或P<0.01）。MI后4周，西洛他唑治療組較非西洛他唑治療組顯著性降低MMP-2的濃度（P值均<0.01）。
　　同

20、MI后2天相比，各組MI后4天血漿中的MMP-9濃度顯著升高（P<0.01），MI后7天血漿中的MMP-9濃度顯著降低（P<0.01）；MI后4周血漿中MMP-9的值較MI后7天的值顯著降低（P<0.01）。MI后4天及1周時，早期介入治療組MMP-9的濃度較延遲介入治療組顯著降低（P值均<0.05）；西洛他唑治療組較非西洛他唑治療組顯著性降低MMP-9的值（P<0.05及P<0.01）。
　　6、隨訪6個月后各組ΔLVEDV和L

21、VEF
　　入選的患者PCI術(shù)后隨訪6個月，復(fù)查心臟超聲，分別測量LVEDV和LVEF。LVEDV同患者6個月前的結(jié)果比較，計算LVEDV的變化量（ΔLVEDV）。結(jié)果顯示，不同處理組間ΔLVEDV差異顯著。同延遲介入治療組相比較，早期介入治療組ΔLVEDV顯著性降低（P<0.05及P<0.01）；西洛他唑治療組較非西洛他唑治療組顯著降低ΔLVEDV值（P值均<0.01）。LVEF在早期介入治療組較延遲介入治療組顯著性升高（P值均