海姆泊芬光動(dòng)力治療BN大鼠脈絡(luò)膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是導(dǎo)致老年性黃斑變性(age—related macular degeneration，AMD)、病理性近視、眼組織胞漿菌病、血管樣條紋等多種疾病視力嚴(yán)重下降的重要原因。現(xiàn)有的治療方法如常規(guī)激光光凝，經(jīng)瞳孔溫?zé)岑煼?transpupillary themlotheraPy，TTT)、視網(wǎng)膜下CNV摘除、黃斑轉(zhuǎn)位手術(shù)等，大多不具選擇性而且容易破壞正常視網(wǎng)膜結(jié)

2、構(gòu)和功能。近年來開展的光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT)，因?yàn)楣饷魟┻x擇性聚集于CNV部位以及對(duì)病變部位采用特定波長的激光照射的雙重選擇性能夠特異性地作用于CNV，而幾乎不損傷周圍正常組織，正成為一種新的、安全有效的治療方法。 目前國內(nèi)外眼科臨床PDT所用的光敏劑Visudyne，是美國FDA批準(zhǔn)的唯一用于眼科臨床的光敏劑，該藥價(jià)格昂貴，對(duì)患者和社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。海姆泊芬是近年來國內(nèi)研制的一

3、種新型光敏劑，具有結(jié)構(gòu)明確、成分單一、光敏作用強(qiáng)、體內(nèi)分布和消除迅速、毒副反應(yīng)小等特點(diǎn)。臨床上已廣泛應(yīng)用于皮膚鮮紅斑痣的治療，眼科方面已有關(guān)于海姆泊芬PDT有效封閉角膜新生血管以及對(duì)正常視網(wǎng)膜生物學(xué)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)性研究。本研究通過觀察海姆泊芬PDT對(duì)BN大鼠CNV以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的作用，評(píng)價(jià)海姆泊芬PDT治療BN大鼠CNV的可行性和有效性，并初步闡明其作用機(jī)制，為海姆泊芬PDT的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。 第一部

4、分半導(dǎo)體激光誘導(dǎo)BN大鼠脈絡(luò)膜新生血管形成目的觀察不同能量的810 nm半導(dǎo)體激光光凝對(duì)棕色挪威(Brown Norway，BN)大鼠CNV形成的影響，探討誘導(dǎo)CNV模型的合適激光參數(shù)。方法健康BN大鼠49只，隨機(jī)取7只作為對(duì)照，其余42只等分為3組。采用功率分別為120 mW、140 mW和160 mW，光斑直徑75 um，曝光時(shí)間100 ms的810 nm半導(dǎo)體激光光凝大鼠雙眼視網(wǎng)膜，光凝后1、3、7、14、21、28及56天行眼底

5、、眼底熒光血管造影(fundus nuorescein angiography，F(xiàn)FA)／吲哚菁綠血管造影(indocyaninegreen angiography，ICGA)、光學(xué)顯微鏡、CD<,34>免疫組織化學(xué)以及透射電子顯微鏡檢查。結(jié)果120 mW、140 mw和160 mw三組光凝后7天出現(xiàn)CNV；21天CNV達(dá)到高峰，此時(shí)以FFA和。ICGA檢查證實(shí)的CNV成模率分別為45．54％、88．18％、85．45％及45．54％、

6、89．09％、91．82％；28天CNV仍處于高峰狀態(tài)，56天CNV有所減少。結(jié)論810 nm半導(dǎo)體激光可成功誘導(dǎo)BN大鼠CNv模型，成模率高，成模高峰位于激光后21天。造模的理想?yún)?shù)為：功率140 mW，光斑直徑75um，曝光時(shí)間100 ms。 第二部分海姆泊芬在BN大鼠眼底組織分布的研究 目的觀察海姆泊芬靜脈注射后不同時(shí)間在BN大鼠CNV眼底組織的濃度分布變化和差異，探討PDT激光照射的合適時(shí)機(jī)。方法雙眼CNV成模

7、BN 大鼠20只，隨機(jī)取4只作眼底血管造影，尾靜脈注射10 mg／Kg海姆泊芬后，采用SLO行視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜血管及CNV連續(xù)、動(dòng)態(tài)觀察；其余16 只大鼠隨機(jī)等分為8組，其中1組為空白對(duì)照組，其余7組在10 mg／kg海姆泊芬靜脈給藥后于3、5、15、30、60、120分鐘和24小時(shí)分別處死，制作石蠟切片，熒光顯微鏡下觀察不同組織的熒光強(qiáng)度。結(jié)果眼底血管造影和熒光顯微鏡檢查均顯示：在靜脈注射海姆泊芬(10mg／kg)后3分鐘時(shí)，脈絡(luò)膜和視

8、網(wǎng)膜血管及CNV中海姆泊芬濃度達(dá)到高峰；15分鐘時(shí)CNv與脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜的濃度差異擴(kuò)大；30分鐘時(shí)脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜濃度接近消失，CNV中仍顯示較高濃度，CNV與脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜之間濃度差異顯著。結(jié)論靜脈注射海姆泊芬(10mg／kg)后30分鐘，BN大鼠CNV與脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜的藥物濃度差異最大，且脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜濃度接近消失，該時(shí)間點(diǎn)可作為海姆泊芬PDT治療BN大鼠CNV的適宜照光時(shí)機(jī)。 第三部分海姆泊芬光動(dòng)力治療BN大鼠CNV的研究

9、 目的觀察相同海姆泊芬藥物劑量、不同能量密度630nm激光照射對(duì)BN 大鼠CNV的影響，評(píng)價(jià)海姆泊芬PDT治療BN大鼠CNV的可行性。方法雙眼CNV成模BN大鼠48只，隨機(jī)等分為8組。1組為空白對(duì)照，1組單純注射海姆泊芬，3組不注射海姆泊芬，單純接受與PDT相同參數(shù)的630 nm激光照射，另3組為PDT組，尾靜脈注射海姆泊芬(10 mg/kg)30分鐘后開始激光照射，所用參數(shù)：光斑直徑3 mm，照光時(shí)間60 S，輸出功率密度分別

10、為600 mW/cm<’2>、800 mW/cm<’2>和1000 mW/cm<’2>(能量密度分別為36 J/cm<’2>、48 J／cm<’2>、60 J／cm<’2>)。治療后1、7、1 4天分別進(jìn)行眼底、FFA、ICGA、光學(xué)顯微鏡以及透射電子顯微鏡檢查，觀察CNV及周圍組織變化。結(jié)果治療后1天，各組CNV熒光滲漏無改變。治療后7天和14天，PDT 800mW/cm<’2>和1000 mW/cm<’2>組以及單純照光1000 m

11、W/cm<’2>組CNV滲漏好轉(zhuǎn)率均高于對(duì)照組，PDT 800 mW/cm<’2>和1000 mW/cm<’2>組滲漏停止率高于其他組別，但兩組之間沒有顯著差異。單純給藥組、單純照光600 mW/cm<’2>和800 mW/cm<’2>組以及PDT 600 mW/cm<’2>組隨訪中均未見CNV滲漏改變。ICGA顯示PDT 800 mW/cm<’2>和1 000 mW/cm<’2>組以及單純激光1 000mW/cm<’2>激光后1天照射

12、部位可見脈絡(luò)膜無灌注，14天時(shí)PDT 800 mW/cm<’2>組脈絡(luò)膜無灌注基本恢復(fù)，但PDT 1 000 mW/cm<’2>組和單純激光1000mW/cm<’2>組仍可見明顯脈絡(luò)膜無灌注。結(jié)論選擇適當(dāng)參數(shù)海姆泊芬PDT能有效閉鎖BN大鼠CNV。當(dāng)靜脈注射海姆泊芬劑量為10 mg/kg時(shí)，推薦的630 nm半導(dǎo)體激光參數(shù)為：光斑直徑3 mm，照光時(shí)間60 S，輸出功率密度800 mW/cm<’2>，可達(dá)到對(duì)周圍視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜損傷最小、

13、療效最好的目的。 第四部分海姆泊芬光動(dòng)力治療對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡的影響目的觀察不同濃度的海姆泊芬PDT對(duì)體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討海姆泊芬PDT治療CNV的可能機(jī)制。方法取體外培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞分為8組，1組為空白對(duì)照，l組單純激光照射，3組細(xì)胞給予與PDT組相同濃度的海姆泊芬但不接受激光照射，另外3組細(xì)胞分別加入濃度為200μg／ml、100μg／ml和50μg／ml海姆泊芬，15分鐘后

14、用波長630 nm的激光照射，激光光斑直徑3 mm，功率密度2000 mW／cm<'2>，照光時(shí)間2 min。于激光照射后4小時(shí)和24小時(shí)分別收集細(xì)胞，采用MTT和PI法觀察海姆泊芬PDT對(duì)HUVEC細(xì)胞體外增殖、細(xì)胞周期的影響，Hoechst 33258熒光染色、透射電子顯微鏡觀察HUVEC細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，Annexin V／PI雙染法經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)HUVEC細(xì)胞凋亡率。結(jié)果海姆泊芬濃度為100μg／ml和200μg／ml的PDT組