RNAi抑制黃斑部脈絡(luò)膜新生血管形成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:黃斑是人視覺(jué)最關(guān)鍵、最敏銳的部位，多種原因均可以導(dǎo)致黃斑部病變，如光損傷、炎癥、外傷、變性、腫瘤等等，常可致不可逆轉(zhuǎn)的視功能障礙。如:老年性黃斑病變(AMD)、病理性近視(PM)、息肉樣脈絡(luò)膜血管病變(PCV)和特發(fā)性脈絡(luò)膜新生血管(ICNV)等等，這些疾病引起眼底改變的病理基礎(chǔ)就是脈絡(luò)膜新生血管(CNV)的生成，若不加以干預(yù)治療，最終發(fā)展均會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的視功能的損害，致盲率很高。黃斑部發(fā)生交性時(shí)，脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層-Bruch'

2、s膜-視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)以及視網(wǎng)膜外層的神經(jīng)細(xì)胞均發(fā)生變性，直接導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織細(xì)胞慢性缺氧、缺血而致使細(xì)胞變性、萎縮等，并使視網(wǎng)膜色素上皮、脈絡(luò)膜毛細(xì)血管基底膜以及Bruch's膜發(fā)生萎縮或增殖。由于脈絡(luò)膜微血管發(fā)生了病變，破壞了RPE的屏障功能和吞噬功能，從而破壞了對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)層感光細(xì)胞的保護(hù)作用，嚴(yán)重影響視功能。黃斑變性的主要眼底表現(xiàn)為色素脫落或色素增殖、硬性及軟性玻璃膜疣(drusen)、滲出、水腫、出血以及最終脈絡(luò)膜新生血管

3、的形成(CNV)。
　　 在關(guān)于觸發(fā)CNV的眾多機(jī)制中，主要有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管生成素(Ang)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)及粘附因子(AM)等等，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與抗血管生成因子之間的失衡尤為重要。VEGF是一種分泌性蛋白質(zhì)，它可以增加血管通透性，引發(fā)炎癥，誘發(fā)新生毛細(xì)血管生成。VEGF廣泛分布于人和動(dòng)物體內(nèi)的多種組織結(jié)構(gòu)中，如大腦、肝臟、腎臟及眼部等等，其中在眼部視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的周細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素

4、上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞均存在VEGF，這對(duì)維持眼部血管完整性起了重要作用。在正常情況下，眼部組織中VEGF蛋白或VEGF蛋白的mRNA的表達(dá)水平很低，但是在缺血、缺氧、炎癥等應(yīng)激情況下，VEGF的蛋白與mRNA的表達(dá)水平均會(huì)明顯增高，從而誘導(dǎo)病態(tài)的新生血管的形成。
　　 大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，在機(jī)體組織新生血管的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，VEGF起主要作用，VEGF的過(guò)度表達(dá)會(huì)促進(jìn)新生血管的形成。因此，眾多的學(xué)者在研究針對(duì)黃斑部CNV的治

5、療藥物時(shí)，都不約而同的將VEGF作為潛在的治療目標(biāo)，比如以VEGF適配子形式出現(xiàn)的哌格太尼（Pegaptanib）或者以抗VEGF抗體片段形式出現(xiàn)的蘭尼單抗(Ranibiumab)等。當(dāng)前，針對(duì)VEGF的抑制劑，主要有以下這些:Pegaptanib、Ranibiumab、Bevacizumab、VEGF-trap、KH902等，雖然這些藥物對(duì)眼部的新生血管有顯著的抑制效果，然而這些治療方法也存在一些不可忽視的問(wèn)題，主要體現(xiàn)在以下兩點(diǎn):首

6、先由于病灶處局部微環(huán)境的病理變化導(dǎo)致VEGF持續(xù)分泌，而以上藥物玻璃體腔注射后不能長(zhǎng)期在患部存在，即使應(yīng)用了各種藥物緩釋技術(shù)，仍無(wú)法達(dá)到長(zhǎng)期抑制.VEGF的需求;更為重要的是這些藥物與VEGF結(jié)合屬于抗原抗體反應(yīng)，則必然有抗原抗體復(fù)合物的生成，由于這些復(fù)合物的代謝較為困難，可能存在加重drusen的危險(xiǎn)。所以我們認(rèn)為，抗VEGF藥物的作用主要在于局部中和病灶處產(chǎn)生的VEGF，而不能抑制病灶處VEGF因子的繼續(xù)生成，因而無(wú)法避免CNV的復(fù)

7、發(fā)，理論上來(lái)說(shuō)，抑制VEGF的產(chǎn)生將比降解它更有利于CNV的治療。
　　 當(dāng)前針對(duì)CNV的治療，除了上述的抗VEGF藥物，另一經(jīng)典有效的治療方法就是光動(dòng)力療法(photodynamic therapy, PDT)，維替泊芬-PDT于2000年正式被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療黃斑區(qū)的CNV，此種方法是采取靜脈內(nèi)注射光敏劑-維替泊芬，而后其與血管內(nèi)低密度脂蛋白相結(jié)合，聚集在眼部病灶新生血管處，再用一種特定波長(zhǎng)的激光照射眼底病灶，照射范圍

8、稍大于眼底血管造影檢查所確定的新生血管范圍，光敏劑受激光激發(fā)后可以把能量傳遞給周圍的氧，生成強(qiáng)活性的單態(tài)氧，單態(tài)氧和相鄰的生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生自由基等細(xì)胞毒性物質(zhì)，并直接作用于CNV使之破壞，并促使局部微血栓的形成，從而使病灶處新生血管發(fā)生閉塞，最終導(dǎo)致新生血管萎縮。PDT可以有效的封閉視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜的新生血管，雖對(duì)正常的視網(wǎng)膜組織基本沒(méi)有損傷，但可造成局部組織缺氧;PDT療法也有其局限性，只能封閉已經(jīng)形成的新生血管，且病灶區(qū)治療

9、后有可能產(chǎn)生瘢痕。盡管PDT為CNV的治療提供了一個(gè)新的思路，然而同抗VEGF藥物一樣，也存在病變區(qū)CNV的復(fù)發(fā)問(wèn)題。因此，治療并預(yù)防黃斑區(qū)CNV惡性發(fā)展的關(guān)鍵在于有針對(duì)性的降低VEGF的產(chǎn)生，從而抑制CNV的形成，以及改善視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的微循環(huán)。
　　 隨著對(duì)眼部的新生血管相關(guān)因子的深入研究，基因治療成為目前較具潛力的眼部新生血管性疾病的治療對(duì)策，尤其是近10年來(lái)興起的核糖核酸干擾(RNAinterference，RNAi)技

10、術(shù)，不但為研究生物體的基因表達(dá)和調(diào)控等功能提供了新方法，同時(shí)也為眼部新生血管性疾病的研究、預(yù)防與治療開(kāi)辟了新途徑、新領(lǐng)域。在基因治療方面，RNAi是沉默特定基因的強(qiáng)有力工具，被廣泛應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域。RNAi由一種小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)所介導(dǎo)，是引起生物細(xì)胞內(nèi)特異同源靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，普遍存在于各種生物體內(nèi)。siRNA由21-23個(gè)核苷酸組成，為RNaseⅢ裂解外源或內(nèi)源

11、性長(zhǎng)的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNAs)分子所形成。在眼部新生血管性疾病的治療研究方面，以VEGF及其受體VEGFR為靶基因，對(duì)體外合成的siRNA或dsRNA進(jìn)行，結(jié)果顯示，相應(yīng)的siRNA可明顯降低VEGF或VEGFR的表達(dá)水平，減輕VEGF對(duì)新生血管形成的誘導(dǎo)作用，抑制眼部新生血管形成，但體外方法無(wú)法大量合成siRNA或dsRNA，而且siRNA不穩(wěn)定、細(xì)胞通透性差、需反復(fù)使用，使其應(yīng)用受到極大限制

12、，無(wú)法普及應(yīng)用。
　　 目前，激光誘導(dǎo)大鼠CNV模型是我們最常用的方法之一，而CNV制模成功的關(guān)鍵在于Bruch's膜的破裂:CNV是脈絡(luò)膜的新生血管通過(guò)破損的Bruch's膜生長(zhǎng)入視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層下，因此如果激光能量過(guò)低而不能擊穿Bruch's膜，或激光時(shí)功率過(guò)大，導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織破壞而瘢痕化，都不能形成有效的CNV模型。目前通常是根據(jù)操作者的經(jīng)驗(yàn)（觀察激光斑有無(wú)出血、氣泡等）來(lái)判斷Bruch's膜是否被擊穿，因此CNV模型成功

13、率都不高。3D-OCT（光學(xué)相干斷層掃描）問(wèn)世以來(lái)，為視網(wǎng)膜的疾病提供了一種全新的診斷指標(biāo)，快速無(wú)創(chuàng)，且可清晰顯示包括Bruch's膜在內(nèi)視網(wǎng)膜橫斷面各層結(jié)構(gòu)，與傳統(tǒng)的時(shí)域OCT相比，頻域OCT具有高分辨率成像和實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的優(yōu)點(diǎn)，還能清楚的反映出CNV與視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層及視網(wǎng)膜色素上皮層之間的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)?？煞窭?D-OCT直視下引導(dǎo)激光誘導(dǎo)色素大鼠CNV模型，從而相比于傳統(tǒng)肉眼下CNV造模，顯著提高CNV模型制備的成功率呢？
　　

14、 本研究擬采用Long-Evans色素大鼠，以其VEGF的mRNA調(diào)控區(qū)為靶基因，構(gòu)建能表達(dá)作用于調(diào)控區(qū)的長(zhǎng)發(fā)夾dsRNA(long-hairpin RNA，lhRNA)的質(zhì)粒，并注射至正常色素大鼠玻璃體腔內(nèi)，然后對(duì)接受質(zhì)粒注射的大鼠進(jìn)行3D-OCT引導(dǎo)下激光誘導(dǎo)CNV，研究VEGF mRNA干擾質(zhì)粒對(duì)CNV形成的抑制作用。研究玻璃體腔注射質(zhì)粒后，能否在大鼠體內(nèi)表達(dá)形成特異性的lhRNA，并觀察此質(zhì)粒對(duì)大鼠CNV的形成是否有抑制作用，期

15、望通過(guò)沉默VEGF-mRNA的調(diào)控區(qū)來(lái)降低VEGF的產(chǎn)生，同時(shí)破壞mRNA的穩(wěn)定性，達(dá)到抑制眼部新生血管形成的作用。該方法能克服體外合成siRNA的諸多不足，為治療應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。同時(shí)，將為眼部新生血管性疾病的治療開(kāi)辟新途徑，提供新思路和新方法。
　　 本課題從以下三個(gè)方面進(jìn)行研究后得到如下結(jié)果和結(jié)論:
　　 第一部分:VEGF基因RNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
　　 目的:構(gòu)建干擾大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(va

16、scular endothelial growth factor,VEGF)基因RNA表達(dá)的重組質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究該RNAi質(zhì)粒在脈絡(luò)膜新生血管形成中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:以Long-Evans大鼠VEGF為靶基因，以pcDNA3.1為質(zhì)粒載體，設(shè)計(jì)3組針對(duì)VEGF基因的RNA干擾(RNA interference，RNAi)序列，應(yīng)用基因重組技術(shù)克隆入載體pcDNA3.1中，重組質(zhì)粒分別命名為pcDNA3.1-VEGF

17、-LH1、pcDNA3.1-VEGF-LH2和pcDNA3.1-VEGF-LH3，并用DNA直接測(cè)序法和雙酶切法鑒定構(gòu)建的重組質(zhì)粒。
　　 結(jié)果:DNA測(cè)序證實(shí)克隆入載體pcDNA3.1(-)中的序列正確，雙酶切、PCR結(jié)果顯示有目的片段的釋放，證實(shí)RNA干擾序列正確插入載體pcDNA3.1(-)。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建針對(duì)VEGF基因的RNAi質(zhì)粒pcDNA3.1-VEGF-LH1、pcDNA3.1-VEGF-LH2和

18、pcDNA3.1-VEGF-LH3，為進(jìn)一步研究該RNAi質(zhì)粒在脈絡(luò)膜新生血管形成中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分:3D-0CT可視引導(dǎo)激光誘導(dǎo)色素大鼠CNv模型
　　 目的:在3D-OCT可視引導(dǎo)下，采用氪紅激光誘導(dǎo)色素大鼠脈絡(luò)膜新生血管(CNV)模型，觀察大鼠CNV模型成功效率。
　　 方法:24只Long-Evans大鼠隨機(jī)分2組，每組12只。均選取右眼為實(shí)驗(yàn)眼，進(jìn)行氪紅激光誘導(dǎo)大鼠CNV:A組為對(duì)照組

19、，非3D-OCT引導(dǎo);B組為實(shí)驗(yàn)組，即在3D-OCT可視引導(dǎo)下行激光誘導(dǎo)大鼠CNV模型。A組在視乳頭周圍1-2PD處予氪激光8點(diǎn)，激光時(shí)肉眼觀察到有氣泡產(chǎn)生或少量出血。B組在眼底激光光凝的同時(shí)，以3D-OCT同步掃描，選擇Bruch's膜被擊穿處光凝斑8點(diǎn)。光凝3周后行眼底照相、眼底血管造影檢查及3D-OCT檢查，比較兩組大鼠CNV模型的成功率。
　　 結(jié)果:光凝后3周，觀察到A、B兩組視網(wǎng)膜水腫均基本消退，可見(jiàn)灰白色激光斑、少

20、數(shù)出血斑周圍見(jiàn)黃白色滲出物，熒光素滲漏。其中A組可見(jiàn)57點(diǎn)出現(xiàn)Bruch's膜破裂、38點(diǎn)出現(xiàn)CNV，B組96點(diǎn)激光斑Bruch's膜均破裂、73點(diǎn)出現(xiàn)CNV。x2檢驗(yàn)兩組有顯著性差異(P＜0.05)。Bruch's膜破裂與CNV出現(xiàn)率呈高度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.64。
　　 結(jié)論:成功誘導(dǎo)CNV模型的關(guān)鍵是Bruch's膜的破壞，3D-OCT直視下引導(dǎo)氪激光誘導(dǎo)為實(shí)驗(yàn)性CNV模型能提高模型的成功率，也為進(jìn)一步研究RNA干擾質(zhì)

21、粒在色素大鼠脈絡(luò)膜新生血管(CNV)形成中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　 第三部分:RNA干擾質(zhì)粒對(duì)激光誘導(dǎo)色素大鼠CNV形成的抑制作用
　　 目的:驗(yàn)證RNA干擾質(zhì)粒對(duì)激光誘導(dǎo)大鼠脈絡(luò)膜新生血管(CNV)的形成是否有抑制作用。
　　 方法:24只Long-Evans大鼠隨機(jī)分2組，每組12只。均選取右眼為實(shí)驗(yàn)眼，A組為空白對(duì)照組，在3D-OCT引導(dǎo)下行氪激光誘導(dǎo)CNV;B組為實(shí)驗(yàn)組，右眼玻璃體腔注射RNA干擾質(zhì)粒后，在

22、3D-OCT引導(dǎo)下行氪激光誘導(dǎo)CNV。在視乳頭周圍1-2PD處予氪激光光凝，激光同時(shí)3D-OCT同步掃描，選擇Bruch's膜被擊穿處光凝斑8點(diǎn)。光凝3周后行眼底照相、3D-OCT及眼底血管造影檢查，比較兩組大鼠CNV模型的成功率。
　　 結(jié)果:3周后，A組全部96點(diǎn)激光斑均出現(xiàn)Bruch's膜破裂、68點(diǎn)出現(xiàn)CNV，B組96點(diǎn)Bruch's膜破裂、19點(diǎn)出現(xiàn)CNV。x2檢驗(yàn)兩組有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論