CFB-siRNA抑制大鼠脈絡(luò)膜新生血管生成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：脈絡(luò)膜新生血管(CNV)是年齡相關(guān)性黃斑變性等眼底疾病造成患者視力嚴(yán)重受損的主要原因之一，其治療較為困難，深入研究CNV的發(fā)病機(jī)制和提供新的治療方法成為目前眼科的研究熱點(diǎn)。目前臨床上常用的治療方法對(duì)于控制疾病的發(fā)展具有一定的作用。但是所有的治療方法主要是針對(duì)已生成的CNV，尚不能從根本上防止CNV的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)。其發(fā)生機(jī)制目前尚未完全闡明，通常認(rèn)為，CNV的生成與RPE-Bruch膜-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體的改變有關(guān)。它的生成和

2、發(fā)展是一個(gè)多細(xì)胞參與、多因子調(diào)控的復(fù)雜過程，炎癥介質(zhì)及補(bǔ)體系統(tǒng)在CNV生成中起到一定的作用。本研究采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，使用前期研究中成功構(gòu)建的CFB-siRNA將CFB沉默，從而阻斷旁路途徑，觀察CFB-siRNA對(duì)激光誘導(dǎo)的大鼠CNV及其相關(guān)生長(zhǎng)因子VEGF、TGF-β2的抑制作用，為從根本上治愈CNV提供可能性。
　　 方法：
　　 1、不同濃度CFB-siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果評(píng)價(jià)
　　 1.18-

3、10周健康棕色挪威（BN）大鼠60只，隨機(jī)分為4組，每組15只。氪激光(波長(zhǎng)647nm，光斑直徑200μm，功率260mW,曝光時(shí)間0.05s)圍繞視盤均勻光凝9-10個(gè)點(diǎn)，以見到有氣泡產(chǎn)生提示Bruch膜被擊穿為準(zhǔn)建立大鼠CNV模型。
　　 1.2隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（尾靜脈生理鹽水注射），低劑量組(25μgB因子siRNA)，中劑量組(50μgB因子siRNA)，高劑量組（75μgB因子siRNA）。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和治療組均給予激

4、光光凝建立大鼠CNV模型。治療組通過尾靜脈注射給藥。注射時(shí)間：B因子表達(dá)高峰的前日即第2天；注射方式：尾靜脈注射，隔天注射一次，共注射三次，觀察時(shí)間為激光后3、7、14、21、28d。
　　 1.3各組大鼠分別于光凝后第3、7、14、21、28d進(jìn)行熒光素眼底血管造影(FFA)。
　　 1.4造影后處死大鼠，摘除眼球取眼后段組織制作石蠟切片。選取有明確血管化的激光斑處做切片，常規(guī)HE染色。
　　 1.5隨機(jī)選取光

5、凝后第3、7、14、21、28d切片，免疫組織化學(xué)方法觀察VEGF、FactorⅧ表達(dá)情況。
　　 1.6圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)各時(shí)間點(diǎn)灰度值進(jìn)行分析，觀察其隨濃度變化的抑制效應(yīng)。
　　 2、觀察激光后大鼠CFB與CNV生成有關(guān)的VEGF、TGF-β2的表達(dá)關(guān)系
　　 2.1隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與高劑量組（75μgB因子siRNA），部分組織標(biāo)本來(lái)源于第一部分。
　　 2.2

6、分別于7、14、21、28d行B因子、VEGF、TGF-β2免疫組化及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)觀察CFB與VEGF、TGF-β的表達(dá)強(qiáng)度關(guān)系。
　　 2.3采用SPSS16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 3、觀察CFB-siRNA對(duì)視網(wǎng)膜的毒性作用
　　 3.1隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與高劑量組（75μgB因子siRNA），組織標(biāo)本來(lái)源于第一部分。并增設(shè)空白對(duì)照組。
　　 3.2分別于7、

7、14、21、28d處死大鼠，摘除眼球取眼后段組織制作石蠟切片。選取遠(yuǎn)離激光斑點(diǎn)處組織做切片，常規(guī)HE染色及透射電鏡觀察。
　　 結(jié)果：
　　 1、不同濃度CFB-siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果評(píng)價(jià)
　　 1.1試驗(yàn)對(duì)照組光凝后7d出現(xiàn)CNV,14d逐漸增多，21d達(dá)高峰。
　　 1.2 FFA表現(xiàn)為造影早期強(qiáng)熒光斑，晚期出現(xiàn)與視網(wǎng)膜血管無(wú)關(guān)的熒光素滲漏。
　　 1.3試驗(yàn)治療組大鼠眼光凝后21dCNV發(fā)生

8、率到達(dá)高峰，但較對(duì)照組明顯降低，各組FFA進(jìn)行比較，高劑量治療組CNV發(fā)生率明顯低于低劑量治療組。
　　 1.4光鏡可見到CNV自脈絡(luò)膜穿過破裂的Bruch膜突向視網(wǎng)膜下，以及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、RPE細(xì)胞遷移增生和纖維母細(xì)胞增多等。
　　 1.5免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示VEGF、FactorⅧ表達(dá)較對(duì)照組均減弱，且高劑量治療組減弱程度高于低劑量治療組。
　　 2、觀察光凝后大鼠CFB與CNV生成有關(guān)的VEGF、TGF

9、-β2的表達(dá)關(guān)系
　　 2.1免疫組化結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)對(duì)照組CFB提前于VEGF、TGF-β2出現(xiàn)，7d后表達(dá)減少，光凝后14天仍有少量表達(dá)。VEGF、TGF-β2表達(dá)高峰均落后于CFB表達(dá)高峰，前兩者在光凝后14-21d出現(xiàn)明顯表達(dá)增多，之后略有下降。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)治療組的CFB在7d時(shí)表達(dá)減少，其后逐漸接近對(duì)照組，VEGF與TGF-β2表達(dá)均顯著降低。
　　 2.2 RT-PCR結(jié)果顯示：在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中，CFB表達(dá)

10、持續(xù)增加，VEGF、TGF-β2呈曲線變化，在21 d表達(dá)高峰；在實(shí)驗(yàn)治療組中，CFB、VEGF、TGF-β2表達(dá)顯著減少，且各時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著變化。
　　 3、觀察CFB-siRNA對(duì)視網(wǎng)膜的毒性作用
　　 各組HE染色后觀察遠(yuǎn)離激光斑點(diǎn)處組織視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，排列規(guī)則，無(wú)明顯異常。透射電鏡檢查結(jié)果顯示：視桿、視錐細(xì)胞完好，但膜盤結(jié)構(gòu)輕度紊亂，間隙稍不規(guī)則。神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞間輕度水腫，神經(jīng)纖維層輕度水腫，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，