玻璃體內(nèi)注射地塞米松-PLGA納米粒對實驗性大鼠脈絡(luò)膜新生血管的抑制作用.pdf

1、研究背景：脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)生成是許多致盲性眼底病晚期共有的病理改變。目前臨床上治療CNV 的方法主要有激光光凝術(shù)、PDT、TTT、手術(shù)切除新生血管膜或黃斑轉(zhuǎn)位及放射治療等，但上述方法均有不足之處。隨著人們對CNV 生成機制認(rèn)識的深入，新生血管抑制劑已成為近年來治療CNV 相關(guān)疾病的研究熱點。糖皮質(zhì)激素（如地塞米松和曲安奈德）為外源性新生血管抑制劑，已用于CNV 相關(guān)疾病

2、的治療。然而，由于眼球壁的阻擋和血-視網(wǎng)膜屏障等因素的存在，糖皮質(zhì)激素經(jīng)大劑量系統(tǒng)給藥后方能達(dá)到治療效果，但極易引起全身性毒副作用；局部滴眼效果差，且很難到達(dá)眼后節(jié)。同時，由于藥物在玻璃體內(nèi)的半衰期較短、代謝速度過快、以及患者個體差異較大等原因，玻璃體內(nèi)注射需多次給藥后方可維持有效治療濃度，且易引起青光眼、白內(nèi)障、玻璃體出血、視網(wǎng)膜脫離及眼內(nèi)炎等并發(fā)癥，因而限制了它在眼后節(jié)疾病方面的應(yīng)用。因此，研制一種既有利于治療而毒副作用降至最低限度

3、的糖皮質(zhì)激素給藥體系是最為理想的方法之一。理想的控釋制劑應(yīng)該是以一種持續(xù)的方式釋藥，并超越所需要的時間期限。 目前，以聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(D,L-lactide-co-glycolide), PLGA]為材料制成的控釋給藥系統(tǒng)如植入體、微球及納米粒等已獲得廣泛應(yīng)用。采用具有生物降解性PLGA 合成的納米給藥系統(tǒng)可控制藥物的釋放速率和機體靶向性給藥，從而最佳優(yōu)化藥物的治療效果、減少毒副反應(yīng)以及消除重復(fù)注射所致的并發(fā)癥

4、。PLGA 具有良好的生物相容性，更重要的是其降解速率和藥物的釋放可通過聚合體的物理化學(xué)性質(zhì)如分子量、親水性和丙交酯與乙醇酸的比值來控制等。與較大的聚合物相比，它的優(yōu)勢在于不僅可以免除植入和取出時所需的手術(shù)操作，而且其降解作用的時間范圍可從數(shù)月至數(shù)年。 目的：探討玻璃體內(nèi)注射醋酸地塞米松(dexamethasone acetate,DA)-PLGA 納米粒對實驗性脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularizat

5、ion,CNV)的抑制效果，并評價其在不同眼組織內(nèi)的釋藥模式。 方法：采用改良的乳化/溶劑蒸發(fā)法制備載藥量為50％的DA-PLGA 納米粒。雄性BN 大鼠180 只，每只動物選取一只眼作為實驗眼，采用激光光凝法建立CNV 模型，對側(cè)眼未處理。隨機將實驗眼分7 組，即50μg、100μg、200μg 和400μg DA-PLGA納米粒組(各30 只)、100μg DA 組(30 只)、空白PLGA納米粒組(15 只)和生理鹽水對照

6、組(15 只)。各組分別給予玻璃體內(nèi)注射的劑量為10μL。光凝后各個時間點行臨床檢查及眼底照相以觀察藥物在玻璃體內(nèi)的消退時間。于光凝后1、3、7、14、21、28 和56d，采用反相高效液相色譜法(reversed-phase high-performance liquid chromatography, RP-HPLC)檢測各組大鼠眼角膜、虹膜、玻璃體和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜組織內(nèi)DA 的藥物濃度。各組于激光前和光凝后第7、14、21、28 和

7、56d 行閃光視網(wǎng)膜電圖檢查(flash-electroretinography, F-ERG)評估視網(wǎng)膜功能。光凝后14d 和56d，通過熒光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography, FFA)觀察CNV 的生成率；之后處死動物，摘除眼球制作標(biāo)本，進行光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察。 結(jié)果：光凝后1d，臨床檢查發(fā)現(xiàn)DA-PLGA 納米粒、空白PLGA 納米粒和DA 玻璃體內(nèi)注射后均可引起明顯

8、的玻璃體混濁，之后藥物逐漸吸收并沉積在玻璃體腔下方。DA 組消退較迅速，至光凝后14d 時藥物基本完全吸收，玻璃體間質(zhì)變清；PLGA 納米粒組消退非常緩慢，至光凝后56d 時在玻璃體腔偏下方仍可見少量殘留的藥物團塊。DA-PLGA 納米粒在實驗眼玻璃體和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜組織中的釋藥模式呈“3 相”，即初始突釋、穩(wěn)態(tài)釋藥和再次突釋，持續(xù)釋藥時間至少56d。DA 原藥的釋藥模式呈“單相”，釋藥時間為14d左右。在實驗全過程中，角膜組織內(nèi)始終未檢

9、測到DA，而虹膜組織僅在給藥后第1d 測得較低濃度的DA。F-ERG 檢查顯示各組在激光前和激光后不同時間點a 波和b 波的振幅值和峰時值無明顯差異(P>0.05)。 光凝后14d和56d，50μg、100μg、200μg和400μg DA-PLGA納米粒組、DA組、空白PLGA納米粒組和生理鹽水對照組CNV的生成率分別為47.4％/46.2％ 、28.2％/25.0％ 、15.8％/15.0％ 、7.9％/7.7％ 、31.6

10、％/35％ 、65.8％/64.1％和65.8％/65.0％。所有DA-PLGA納米粒組和DA組CNV的生成率較空白PLGA納米粒組和生理鹽水對照組明顯降低(P<0.01，χ2分割法)，但各治療組內(nèi)無明顯差異(P>0.05)。其中，400μgDA-PLGA納米粒組CNV的生成率明顯低于50μg和100μgDA-PLGA納米粒組(P<0.05)。光凝后56d，DA組中部分原來無熒光素滲漏的光凝斑又重新出現(xiàn)熒光素滲漏。 光凝后56d

11、，光凝區(qū)纖維血管組織增生(fibrovascular proliferation, FVP)的平均厚度在50μg、100μg、200μg 和400μg DA-PLGA 納米粒組、DA 組、空白PLGA 納米粒組和生理鹽水對照組中分別為84.77±9.79μm 、69.52±10.52μm 、53.17±13.83μm 、38.39±7.87μm 、70.49±12.39μm 、103.86±16.36μm 和105.11±13.70μm

12、。所有DA-PLGA 納米粒組和DA 組FVP的平均厚度較空白PLGA 納米粒組和生理鹽水對照組顯著變薄(P<0.01，SNK-q 檢驗)。不同劑量DA-PLGA 納米粒組組間兩兩比較均有顯著性差異(P<0.05)。透射電子顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，光凝后14d，400μgDA-PLGA 納米粒組和DA 組的RPE 層紊亂、外節(jié)膜盤結(jié)構(gòu)模糊，視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層和神經(jīng)纖維層的線粒體明顯空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，高爾基復(fù)合體排列紊亂，微管腫脹及微絲排列紊亂。至

13、光凝后56d，400μgDA-PLGA 納米粒組RPE 層、外節(jié)膜盤、視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層和神經(jīng)纖維層的超微結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，而DA 組未見明顯改變。50μg、100μg、200μgDA-PLGA 納米粒組的RPE 層、外節(jié)膜盤、內(nèi)外核層及內(nèi)外叢狀層的超微結(jié)構(gòu)均無明顯異常。 結(jié)論：玻璃體內(nèi)注射DA-PLGA 納米?？沙蕜┝恳蕾囆缘匾种茖嶒炐訡NV 的生長。與DA 原藥相比，DA-PLGA 納米粒具有毒性低、緩釋及藥效持久等特性，有可能