血清microRNA(miRNA)作為胰腺癌診斷和預后生物標志物的研究.pdf

1、目前，全球胰腺癌新發(fā)病例多達23萬/年。平均中位生存時間僅有4到6個月，已成為威脅我國人民生命健康的一大殺手。胰腺癌病人的5年生存率從早期病人的超過50％，迅速下降到進展期病人的不足5％。雖然手術切除是較為有效的胰腺癌治療手段，但是一直以來由于缺乏良好的診斷標志物，胰腺癌的診斷困難，尤其是早期胰腺癌的診斷缺乏特異的診斷標志物一直是該疾病生存期短、預后不良的主要原因之一。目前臨床采用的影像學及一些標志物如CEA，CA19-9等的敏感性和特

2、異性都不夠高。另外，胰液的分子標志物、胰腺管刷檢、組織穿刺等方法也在臨床中有所應用，但是這些方法操作復雜，標本取材困難，臨床應用存在一定難度。對于胰腺癌病人如能早期診斷，早期手術切除將大大改善病人的預后與生存。本研究的目的主要是鑒定胰腺癌特異的血清miRNA表達譜，驗證其作為胰腺癌診斷標志物的特異性與敏感性，并觀察其與胰腺癌病人生存及預后之間的關系。
　　miRNA(microRNA)是一類長約19-23個核苷酸的小分子單鏈RNA

3、，它由一段具有發(fā)夾結構的單鏈RNA前體經Drosha酶和Dicer酶的剪切后生成。miRNA通過與目標mRNA分子的3’端非編碼區(qū)域(3’-UTR)互補配對，使目標mRNA分子的翻譯受到抑制或引起特異性的對mRNA分子的切割，從而在轉錄后水平對靶基因的表達進行調控。大量研究成果表明，miRNA參與著生物體中很多基本生命過程的調控，在生命活動中起著非常重要的作用，miRNA分子不僅自身作為功能分子發(fā)揮作用，還廣泛參與和決定基因表達調控和蛋

4、白質翻譯，進而影響細胞的新陳代謝等所有生命過程。miRNA標志物將成為疾病發(fā)生發(fā)展相關基因標志物、蛋白質標志物和代謝物標志物整體“網(wǎng)絡”中的“結點”。雖然腫瘤組織中的miRNA可以作為一種新的腫瘤標志物，但是，為了獲得腫瘤組織miRNA，勢必需要進行有創(chuàng)的手術或者穿刺等，所以組織miRNA仍然不能滿足早期診斷的需要，仍然不能適用于廣泛的篩查和預防?；诖?，研究人員將目光投向較易獲得，甚至常規(guī)體檢中就可以收集到的血液。血清的檢測是無創(chuàng)的、

5、非侵入的，因此可以適用于普查和預防，為早期診斷服務。隨著miRNA研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)血清、血漿及其它體液中存在miRNA，并發(fā)現(xiàn)這些體液來源的miRNA能非侵入地診斷腫瘤等疾病及判斷預后。
　　本研究收集了157份胰腺癌及138份年齡性別相匹配的正常對照。初步采用單分子微陣列(solexa)高通量小分子測序對兩組病人的混合血清進行篩選，得出差異表達的血清miRNA，隨后通過定量PCR(qRT-PCR)對初篩階段差異表達的血清mi

6、RNA進行大規(guī)模、單樣本、二階段的精確定量驗證。通過聚類分析、風險評分分析、曲線下面積分析評估該組血清miRNA表達譜對胰腺癌診斷的準確性及可靠性。另選取82例慢性胰腺炎作為第二對照，進一步驗證該組標志物對胰腺癌病人和其高危人群慢性胰腺炎的區(qū)分能力。進一步選取69例樣本(胰腺癌+正常對照)進行雙盲實驗驗證，操作者與結果分析者均不知曉樣本信息前提下進行實驗及分析驗證其診斷的準確性。另選取55例臨床疑似胰腺癌的病例進行前瞻性分析，結合后續(xù)該

7、55例樣本的臨床病理診斷來評價該組血清miRNA作為胰腺癌診斷生物標志物的準確性。
　　通過初步高通量的Solexa測序篩選及qRT-PCR驗證過程，得到7個在胰腺癌與正常對照樣本間穩(wěn)定差異表達的miRNA，即：miR-20a，miR-21，miR-24，miR-25，miR-99a，miR-185，及miR-191。采用風險系數(shù)評分標準進一步評價7個miRNA表達系統(tǒng)對胰腺癌的診斷能力。該組血清miRNA作為標志物能夠將各種階段

8、的胰腺癌與正常對照樣本以較高的敏感性和特異性區(qū)分開來，而且，同樣能夠準確的區(qū)分胰腺癌與慢性胰腺炎病例，表明該組標志物是胰腺癌的特異性標志物。進一步構建受試者工作特征曲線(ROC)，先采用風險評分方法分別評估所有樣本的7個血清miRNA的敏感性及特異性，由此構建ROC，對于第一驗證階段及第二驗證階段得到的曲線下面積(AUC)分別是0.992及0.985。通過對7個血清miRNA與生存時間的分析發(fā)現(xiàn)，miR-21的表達水平與病人的生存期有著

9、明顯的相關性，可以作為預后因子對病人的預后起到提示作用，miR-21高表達的病人預后相對較差。通過多因素分析結果發(fā)現(xiàn)，miR-21是預后的獨立影響因素。進一步的研究結果發(fā)現(xiàn)，以69例樣本(胰腺癌+正常對照)進行雙盲驗證結果發(fā)現(xiàn)，該組標志物的敏感性與特異性分別為86.5％及87.5％。高于CA19-9(敏感性70.0％，特異性68.9％)及CEA(敏感性71.4％，特異性73.3％)的敏感性與特異性。以7個血清miRNA作為標志物對55例

10、高度疑似胰腺癌的初診病人進行檢測，后通過隨訪經臨床病理確診診斷，該血清標志物的診斷準確率為83.64％。
　　通過以上研究鑒定出的7個血清miRNA能夠準確的區(qū)別胰腺癌與正常對照樣本及慢性胰腺炎樣本，該組標志物可以改進單一的分子標記物所難以克服的低特異性和低靈敏度問題，能顯著提高胰腺癌的臨床檢出率，成為早期診斷的有效手段。7個血清miRNA作為一種新奇的無創(chuàng)胰腺癌診斷和預后標志物具有良好的臨床應用潛力。如能將血清miRNA推廣應用