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文檔簡介
1、結(jié)直腸癌(colo rectal cancer,CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一,在我國,結(jié)直腸癌死亡率居惡性腫瘤第五位,其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)。結(jié)直腸癌大多經(jīng)歷了正常粘膜—腺瘤—腺癌的發(fā)展過程,即Nornal-Adenoma-Adenocarcinoma(N-A-AC)學(xué)說。腺癌是結(jié)直腸癌最主要的組織學(xué)類型,而腺瘤被公認(rèn)為結(jié)直腸腺癌最重要的癌前病變。結(jié)直腸腺癌早期不易發(fā)現(xiàn),大多患者就診時(shí)已到中晚期,盡管診療技術(shù)不斷發(fā)展,患者
2、術(shù)后5年生存率并無明顯改善,缺乏有效的診斷方法實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)直腸腺癌及其癌前病變的早期診治是主要的原因之一,若能早期發(fā)現(xiàn)并切除結(jié)直腸腺癌及其腺瘤病變,將有助于降低其發(fā)病率及死亡率。目前,臨床上結(jié)直腸腺癌早期診斷主要依賴于腸鏡、影像學(xué)檢查和血清學(xué)標(biāo)志物癌胚抗原(Carcinoembryonicantigen,CEA)等,因具有侵入性或敏感性、特異性不足,而無法滿足臨床需求。尋找敏感性、特異性高的生物標(biāo)志物用于結(jié)直腸腺癌早期診斷仍是臨床亟待解決的
3、難題。
MicroRNA(miRNA)是一類長度約19-24個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA,其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn),血液中存在豐富而穩(wěn)定的miRNA,其表達(dá)譜具有明顯的組織特異性,在不同腫瘤中具有特異的表達(dá)譜,是具有潛在價(jià)值的腫瘤早期診斷生物標(biāo)志物。單一miRNA作為標(biāo)志物的敏感性和特異性仍難以滿足臨床需求,將差異miRNA組合建立腫瘤特異性表達(dá)譜將改進(jìn)單一分子標(biāo)志物難以克服的低靈敏度、低特異性問題,
4、成為早期診斷的有效手段。若能獲得結(jié)直腸癌血清miRNA表達(dá)譜,可為其早期診斷提供一條新途徑。
在miRNA表達(dá)研究中,很多因素(如RNA的數(shù)量和濃度)可導(dǎo)致樣品測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)偏差。目前,RT-qPCR是miRNA定量檢測(cè)最常用的方法,選用恰當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因是RT-qPCR定量檢測(cè)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化最常用的方法,在miRNA研究中發(fā)揮重要作用。對(duì)于結(jié)直腸腺癌、腺瘤外周血miRNART-qPCR定量檢測(cè),目前尚無適宜內(nèi)參基因篩選的相關(guān)研究報(bào)道。
5、
基于上述問題,本課題采用高通量Miseq測(cè)序技術(shù),對(duì)結(jié)直腸腺癌、腺瘤和健康對(duì)照組的血清miRNA進(jìn)行了系統(tǒng)分析,確定標(biāo)準(zhǔn)篩選三組間無差異表達(dá)的miRNA和三組間漸進(jìn)性升高或降低的差異表達(dá)miRNA,對(duì)上述無差異表達(dá)的miRNA進(jìn)一步RT-qPCR驗(yàn)證,并經(jīng)geNorm、Normfinder軟件評(píng)估,篩選用于結(jié)直腸腺癌血清miRNART-qPCR測(cè)定的最適合內(nèi)參,為下一步結(jié)直腸腺癌血清miRNA差異表達(dá)檢測(cè)及數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化分析提供
6、了保障;以篩選出的內(nèi)參基因作為內(nèi)對(duì)照,將上述差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行逐個(gè)RT-qPCR驗(yàn)證,篩選差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNA,運(yùn)用ROC曲線評(píng)估各差異miRNA的診斷價(jià)值;采用多元logistic回歸分析方法將差異miRNA引入回歸方程,建立logit(P)判別公式,構(gòu)建miRNApanel;同時(shí),對(duì)miRNApanel采用盲法分析,進(jìn)行大樣本臨床驗(yàn)證,評(píng)估其在結(jié)直腸腺癌診斷及鑒別診斷中的應(yīng)用價(jià)值。
第一部分:結(jié)直腸腺癌血清m
7、icroRNART-qPCR檢測(cè)最適內(nèi)參基因的選擇與驗(yàn)證
研究目的:
實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)是目前血清microRNA(miRNA)最常用的檢測(cè)方法,內(nèi)參基因的選擇對(duì)獲得可靠RT-qPCR分析數(shù)據(jù)至關(guān)重要。本研究旨在對(duì)結(jié)直腸腺癌患者血清miRNA定量PCR檢測(cè)中的內(nèi)參基因進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估與驗(yàn)證,篩選最適內(nèi)參基因。
方法:
收集30例結(jié)直腸腺癌、25例結(jié)直腸腺瘤和30例健康對(duì)照血清,采用高
8、通量Miseq測(cè)序技術(shù)對(duì)三組混合樣本進(jìn)行測(cè)序,選擇在三組樣本中表達(dá)無差異的miRNA作為候選內(nèi)參基因;采用RT-qPCR技術(shù)在45例結(jié)直腸腺癌、40例結(jié)直腸腺瘤和40例健康對(duì)照血清中對(duì)篩選出的候選內(nèi)參基因和常用內(nèi)參基因U6snRNA進(jìn)行驗(yàn)證;利用geNorm和NormFinder兩種運(yùn)算法則評(píng)估內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性,進(jìn)一步選擇最適內(nèi)參基因;在60例結(jié)直腸腺癌、60例結(jié)直腸腺瘤和60例健康對(duì)照血清中對(duì)篩選出的最優(yōu)內(nèi)參基因進(jìn)行驗(yàn)證,并采用篩
9、選出的內(nèi)參基因評(píng)估m(xù)iR-92a-3p在結(jié)直腸腺癌患者血清中的表達(dá)。
結(jié)果:
1.候選內(nèi)參基因的測(cè)序篩選:結(jié)直腸腺癌組與腺瘤組、結(jié)直腸腺癌組與健康對(duì)照組、腺瘤組與健康對(duì)照組兩兩比較發(fā)現(xiàn),拷貝數(shù)大于50且兩組間表達(dá)無差異的miRNA分別為17個(gè)、32個(gè)和25個(gè)。進(jìn)一步分析,得到三組間表達(dá)均無差異的miRNA共13個(gè),作為候選內(nèi)參基因。
2.候選內(nèi)參基因的RT-qPCR驗(yàn)證:上述候選內(nèi)參基因中,有5個(gè)miRNA
10、(miR-151a-3p,miR-4446-3p,miR-221-3p,miR-93-5p和miR-3184-3p)在音分標(biāo)本中無法檢測(cè)到;miR-197-3p和miR-26a-5p的平均Cq值大于35;miR-103b,miR-484,miR-16-5p,miR-3615,miR-18a-3p,miR-191-5p和U6snRNA均可在所有標(biāo)本中檢測(cè)到且平均Cq值小于35。
3.所選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)估:采用geNorm和
11、NormFinder兩個(gè)運(yùn)算軟件評(píng)估上述7個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性,GeNorm分析結(jié)果顯示miR-191-5p,miR-16-5p,U6snRNA和miR-18a-3p可作為內(nèi)參基因;geNorm和NormFinder均顯示miR-191-5p是表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因,miR-191-5p和U6snRNA組合是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合。
4.最適內(nèi)參基因的驗(yàn)證:在另一獨(dú)立大樣本中進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示miR-191-5p,U6snRNA和m
12、iR-191-5p+U6snRNA組合在結(jié)直腸腺癌、腺瘤和健康對(duì)照組中表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在結(jié)直腸腺癌的不同分期患者中表達(dá)也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
5.MiR-92a-3p分子的表達(dá):采用miR-191-5p+U6snRNA組合作為內(nèi)參,檢測(cè)血清miR-92a-3p分子在不同組的表達(dá)。結(jié)果顯示,miR-92a-3p在結(jié)直腸腺癌患者中表達(dá)高于腺瘤和健康對(duì)照組(P<0.001),在腺瘤患者中的表達(dá)高于健康對(duì)照(P<0.001)。MiR-9
13、2a-3p的表達(dá)隨結(jié)直腸癌患者TNM分期的進(jìn)展而升高,血清miR-92a-3p表達(dá)在結(jié)直腸腺癌患者Ⅰ期與Ⅲ/Ⅳ期,Ⅱ期與Ⅲ/Ⅳ期,Ⅲ期與Ⅳ期差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而在Ⅰ期與Ⅱ期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.66)。
結(jié)論:
MiR-191-5p和U6snRNA的組合可作為結(jié)直腸腺癌、結(jié)直腸腺瘤和健康對(duì)照血清中miRNART-qPCR檢測(cè)的最適宜內(nèi)參基因。
第二部分:結(jié)直腸腺癌血清microRNApanel的建立及
14、臨床應(yīng)用
研究目的:
結(jié)直腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤,目前用于其早期診斷的方法或具侵入性、或敏感性特異性不足尚無法滿足臨床需求。血清中存在豐富而穩(wěn)定的miRNA,其作為標(biāo)志物為腫瘤早期診斷提供了一條新途徑。本研究旨在篩選結(jié)直腸腺癌差異表達(dá)miRNA,進(jìn)而構(gòu)建miRNApanel用于結(jié)直腸腺癌的早期診斷。
方法:
收集30例結(jié)直腸腺癌、25例結(jié)直腸腺瘤和30例健康對(duì)照血清,采用高通量Miseq測(cè)
15、序技術(shù)對(duì)三組混合樣本進(jìn)行測(cè)序,篩選結(jié)直腸腺癌差異表達(dá)miRNA,作為候選標(biāo)志物。采用RT-qPCR技術(shù)對(duì)上述差異miRNA驗(yàn)證,進(jìn)一步篩選差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNA,將差異miRNA引入多元logistic回歸分析,建立miRNApanel,采用ROC曲線評(píng)估該miRNApanel的診斷價(jià)值。
結(jié)果:
1.候選標(biāo)志物的篩選:測(cè)序結(jié)果顯示:結(jié)直腸腺癌、腺瘤和健康對(duì)照組血清中拷貝數(shù)大于10的miRNA分別為348,30
16、3和283個(gè)。根據(jù)確定的篩選標(biāo)準(zhǔn),miR-195-5p,miR-92a-3p,miR-1290,miR-582-5p,miR-223-3p,miR-136-5p,miR-3074-5p,miR-29a-3p,miR-221-3p,miR-148a-3p,miR-19a-3p和miR-17-3p在健康對(duì)照組、腺瘤和結(jié)直腸腺癌組呈漸進(jìn)性高表達(dá),而miR-422a,miR-1260a和miR-4502呈漸進(jìn)性低表達(dá)。
2.差異miR
17、NA的RT-qPCR驗(yàn)證:將上述15個(gè)差異表達(dá)miRNA在80個(gè)獨(dú)立樣本中進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示miR-19a-3p,miR-223-3p和miR-92a-3p在結(jié)直腸腺癌組表達(dá)高于腺瘤和對(duì)照,腺瘤組表達(dá)高于健康對(duì)照;miR-422a則呈漸進(jìn)性低表達(dá)。進(jìn)一步在240個(gè)樣本中檢測(cè),ROC曲線評(píng)估m(xù)iR-19a-3p,miR-92a-3p,miR-223-3p和miR-422a診斷結(jié)直腸腺癌的AUC分別為0.849,0.871,0
18、.890和0.843。
3.miRNAspanel的建立:將miR-19a-3p,miR-92a-3p,miR-223-3p和miR-422a引入多元logistic回歸分析,得到結(jié)直腸腺癌的判別公式為:logit(P)=0.3313-0.0081*miR-19a-3p-0.0257*miR-92a-3p-0.0406*miR-223-3p+0.1328*miR-422a,該4-miRNApanel診斷結(jié)直腸腺癌的AUC為0.
19、960。
4.miRNAspanel診斷價(jià)值驗(yàn)證:進(jìn)一步在獨(dú)立樣本中驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),4-miRNApanel診斷結(jié)直腸腺癌的AUC為0.951(95%CI:0.907-0.978;敏感性和特異性分別為84.3%和91.6%),高于傳統(tǒng)標(biāo)志物CEA(AUC:0.667,95%CI:0.593-0.735,P<0.001);在CEA陽性組(>5ng/mL),其診斷AUC為0.918(95%CI:0.861-0.957;敏感性和特異性分別
20、為76.79%和85.56%);CEA陰性組(<5ng/mL),其診斷AUC為0.810(95%CI:0.725-0.818;敏感性和特異性分別為57.14%和86.67%);該4-miRNApanel診斷結(jié)直腸腺癌TNMⅠ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ患者的AUC分別為0.942,0.935,0.954和0.983;同時(shí)我們還分析了該4-miRNApanel對(duì)腺瘤的診斷和鑒別診斷價(jià)值,發(fā)現(xiàn)其鑒別診斷腺瘤和腺癌的AUC為0.886,區(qū)分腺瘤和健康對(duì)照的A
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