S-poly(T)PCR篩選結(jié)直腸癌血漿miRNA作為診斷標記物的研究.pdf

1、目的：結(jié)直腸癌(Colorectal Cancer。CRC)是目前常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率較高，早期診斷及治療是降低結(jié)直腸癌病死率、改善預后的重要途徑。目前，臨床缺乏創(chuàng)傷小、花費低、高靈敏度和特異度的結(jié)直腸癌診斷手段，尋找一種有效、可靠的早期診斷方式至關(guān)重要。目前，越來越多的研究表明非編碼小RNA(microRNA。miRNA)在結(jié)直腸癌患者血漿中異常表達，有望成為早期診斷的新標志物。
　　本研究將探討利用S-poly

2、(T) PCR篩選結(jié)直腸癌相關(guān)miRNA，了解其成為結(jié)直腸癌診斷標志物的可行性及臨床價值，并對篩選出的miRNA進一步行生物信息學分析，尋求miRNA可作為結(jié)直腸癌診斷標志物的理論依據(jù)。
　　方法：本院病理確診的101例結(jié)直腸癌患者、20例結(jié)直腸非癌性息肉，134例健康人血漿樣本第一步（初篩階段）將結(jié)直腸癌53例以及健康人87例分別混合為一份，利用S-poly(T) PCR技術(shù)，對已知血液中表達的485miRNA進行檢測篩選出存在

3、顯著性異常表達的miRNA。第二步（復篩階段）將此前53例結(jié)直腸癌樣本按照TNM分期，將結(jié)直腸癌I-II期33例、結(jié)直腸癌III-IV期20例及健康人87例樣本分別混合成一份，利用S-poly(T) PCR技術(shù)，對第一步中篩選出差異表達的miRNA進行檢測，選出備選miRNA用于單個驗證。第三步（驗證階段）對48例結(jié)直腸癌、20例結(jié)直腸非癌性息肉、47例健康人血漿樣本進行單個驗證，分析各miRNA表達水平與病理分期、腫瘤大小、腫瘤位置等

4、的相關(guān)性，評估m(xù)iRNA對結(jié)直腸癌的臨床診斷能力。
　　通過生物信息學預測在第一部分篩選出的結(jié)直腸癌相關(guān)miRNA的靶基因，并對靶基因功能富集分析、信號轉(zhuǎn)導通路富集分析，為篩選出的miRNA用于結(jié)直腸癌診斷提供部分理論依據(jù)。
　　結(jié)果：初篩階段對本院收集的53例結(jié)直腸癌、87例健康人分別做血漿混合樣本，利用S-poly(T) PCR技術(shù)檢測485個miRNA，按照以下標準：FC（fold change）>1或FC<-1、p<

5、0.05，單個樣本Ct值<35。篩選出顯著差異的16種miRNA，其中2種miRNA上調(diào)，14種miRNA下調(diào)。復篩階段利用S-poly(T) PCR技術(shù)檢測16種miRNA，按照三組間均差異表達的標準，最終選定9種miRNA用于單個驗證，其中8種miRNA下調(diào)表達，1種miRNA上調(diào)表達。對48例結(jié)直腸癌、20例非癌性息肉、47例正常對照組血漿樣本進行單個驗證，結(jié)果顯示：其中7種miRNA可顯著區(qū)分結(jié)直腸癌與正常人：miR-27a-3

6、p（t=6.11，p<0.00）、miR-144-3p（t=7.34，p<0.00）、miR-148a-3p（t=5.01，p<0.00）、miR-423-3p（t=6.48。p<0.00）、miR-424-5p（t=6.68，p<0.00）、miR-425-5p（t=7.74，p<0.00）、miR-1260b（t=4.87，p<0.00），此7種miRNA均為下調(diào)表達。其靈敏度和特異度可分別達到：75.0％和85.0%、72.9%和

7、78.7%、93.8%和78.7%、79.2%和91.5%、79.2%和93.6%、83.3%和91.5%、81.3%和83.3%。經(jīng)過一致性檢驗，提示上述miRNA和金標準石蠟病理診斷有較好的一致性。利用logistic回歸進行分析，獲得最佳診斷組合：miR-144-3p、miR-425-5p、miR-1260b，其組合的靈敏度和特異性可分別達到93.8%和91.3%。在分析miRNA表達水平與分期、腫瘤大小、腫瘤位置相關(guān)性時，并未發(fā)

8、現(xiàn)可用于區(qū)分分期、腫瘤大小、腫瘤位置的miRNA。
　　通過生物信息學方法對第一部分篩選出的3種 miRNA診斷組合（miR-144-3p、miR-425-5p、miR-1260b）進行靶基因預測、KEGG及Reactome信號通路分析，利用KEGG生物通路數(shù)據(jù)庫對3種miRNA差異表達的靶基因進行生物通路富集分析，發(fā)現(xiàn)miR-144-3p顯著富集于軸突傳導通路，miR-425-5p主要富集于Ca離子信號通路。利用Reactome

9、生物學反應及信號通路數(shù)據(jù)庫對3種miRNA差異表達的靶基因進行生物通路富集分析，發(fā)現(xiàn)miR-144-3p主要富集到PI3K、PDGF等經(jīng)典傳導通路，miR-425-5p主要富集到鳥苷酸環(huán)化酶、cGMP等相關(guān)通路。
　　結(jié)論：本研究利用S-poly(T) PCR篩選結(jié)直腸癌miRNA診斷標記物，經(jīng)過三步法篩選出miR-27a-3p、miR-143-3p、miR-144-3p、miR-148a-3p、miR-424-5p、miR-42

10、5-5p、miR-1260b等7個miRNA對結(jié)直腸癌診斷具有臨床標記物價值，與病理石蠟診斷有較好的一致性；miR-144-3p、miR-425-5p、miR-1260b三種miRNA聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的靈敏度和特異性均超過90%，遠超過目前臨床常用的CEA等腫瘤標志物，具有潛在臨床應用價值。
　　生物信息學結(jié)果顯示miR-144-3p顯著富集于軸突傳導、PI3K、PDGF等傳導通路。miR-425-5p主要富集于Ca離子信號通路、