基于HCR的miRNAs液相芯片檢測體系的建立及S-poly(T)PCR篩選非小細胞肺癌miRNAs標志物的研究.pdf

1、目的：利用S-poly(T) PCR檢測技術(shù)，對非小細胞肺癌（NSCLC）患者血漿miRNAs分階段篩選，旨在獲得對NSCLC具有早期診斷價值的miRNAs組合，為NSCLC早期診斷提供新的生物學標記。
　　方法：利用S-poly(T) PCR檢測技術(shù)，篩選280例NSCLC患者和277例健康人血漿中特異的miRNAs。第一步，我們將126例Ⅰ期NSCLC患者血漿、154例Ⅱ~Ⅳ期NSCLC患者血漿、277例正常人血漿，各混合為一

2、份，檢測486個miRNAs的表達，篩選出在Ⅰ期或Ⅱ~Ⅳ期NSCLC患者血漿中有差異表達的126個miRNAs。第二步，將92例腺癌Ⅰ期患者血漿、108例腺癌Ⅱ~Ⅳ期患者血漿，以及34例鱗癌Ⅰ期患者血漿、46例鱗癌Ⅱ~Ⅳ期患者血漿和277例正常人血漿，各混合為一份。對第一階段篩選出的126種miRNA進行檢測，獲得40個腺癌差異表達的miRNAs和42個鱗癌差異表達的miRNAs。第三步，預實驗篩選出10個腺癌特異的miRNAs和9個鱗

3、癌特異的miRNAs后，利用上述指標進一步對280例NSCLC患者血漿和277例健康人血漿做單樣本驗證，并利用Logistic回歸分析，獲得NSCLC的miRNAs早期診斷標準，同時對入選診斷標準的miRNAs的表達情況與患者臨床分期進行相關性分析。
　　結(jié)果：通過三步篩選，并對篩選出的10個腺癌特異的miRNAs和9個鱗癌特異的miRNAs進行單樣本驗證，利用Logistic回歸分析，miR-451a、miR-152-3p、mi

4、R-183-5p、miR-144-3p入選腺癌診斷標準（Cma）；miR-152-3p、miR-139-5p、miR-550a-3p入選鱗癌診斷標準（Cms）。受試者工作曲線（ROC）分析顯示，腺癌診斷標準中的4個miRNAs的ROC曲線下面積（AUC）為0.592-0.803，靈敏度為35.2-60.2％，特異度為82.2-93.3%；而由miR-451a、miR-152-3p、miR-183-5p、miR-144-3p組合的Cma檢

5、測腺癌的AUC為0.935，靈敏度為79.6%，特異度為97.8%，診斷價值比任一單基因高。另一方面，miR-152-3p、miR-139-5p、miR-550a-3p診斷鱗癌的AUC為0.515-0.870，靈敏度為41.8-74.7%，特異度為72.2-96.7%；而由這3個miRNAs組成的鱗癌診斷標準Cms對鱗癌的診斷價值可提高至AUC0.981，靈敏度92.4%，特異度91.1%。相關性分析顯示Cma及Cms均與腺癌分期正相關

6、。
　　結(jié)論：miR-451a、miR-152-3p、miR-183-5p、miR-144-3p聯(lián)合診斷腺癌。miR-152-3p、miR-139-5p、miR-550a-3p聯(lián)合診斷鱗癌，是肺癌早期診斷中具有潛在診斷價值的新的非侵入性生物標志物。
　　目的：由于無細胞體液臨床樣本中miRNAs含量較低，我們建立了基于鏈雜交反應（HCR）信號放大體系的miRNAs液相芯片檢測方法，以解決液相芯片miRNAs檢出限（LOD）較

7、高的問題，為臨床樣本多重miRNAs檢測奠定基礎。
　　方法：我們設計了一種新型的發(fā)夾結(jié)構(gòu)探針（探針M），它包括一段微球連接序列、一段與目標miRNA互補的序列、以及一段可引發(fā)HCR反應的序列。探針M變性退火后形成莖-環(huán)二級結(jié)構(gòu)，并首先在體系中被微球被捉。當目標miRNAs存在時，體系中相應的探針M即打開其發(fā)夾結(jié)構(gòu)，釋放HCR引發(fā)鏈，從而引發(fā)兩個生物素標記的莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA單體（探針1及探針2）發(fā)生一系列的鏈雜交反應。隨著反應進行，

8、生物素被探針帶到微球表面。當鏈霉素親和素-藻紅蛋白（SA-PE）被加入體系后，各微球表面即可富集到大量的熒光信號，從而實現(xiàn)信號放大。檢測時，Luminex儀器可同時識別微球的顏色和熒光強度，從而對樣本中的miRNAs進行定性及定量分析。
　　結(jié)果：研究結(jié)果表明，HCR信號放大策略的加入使let-7a的定量限降低到了0.1pM，靈敏度是傳統(tǒng)液相芯片的10倍。另外，本方法還能以較高的特異性區(qū)分不同miRNAs的序列差異，并可成功運用于