基于光子晶體編碼液相芯片的腫瘤標(biāo)志物分析.pdf

1、受到全球人口不斷增多，社會(huì)老齡化趨勢(shì)日益加重，環(huán)境不斷惡化，人們致癌行為逐漸增多等眾多因素的影響，惡性腫瘤的發(fā)病率與死亡率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。目前，惡性腫瘤已成為發(fā)展中國家的首要死因及發(fā)達(dá)國家的第二死因。如此驚人的高死亡率歸結(jié)于惡性腫瘤發(fā)病早期的隱蔽性和病程晚期缺乏有效的治愈手段。WHO推薦進(jìn)行惡性腫瘤的二級(jí)預(yù)防工作，即惡性腫瘤的早期篩查、早期診斷和早期治療，并提示95％的惡性腫瘤可以通過早期發(fā)現(xiàn)與治療而治愈。影像學(xué)檢查和血清學(xué)檢查是兩

2、種有效的惡性腫瘤篩查手段，但是相比較而言，血清學(xué)檢查可以在更早期，即腫瘤細(xì)胞數(shù)目約108，瘤體直徑約0.5cm時(shí)，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的存在。腫瘤標(biāo)志物是血清學(xué)檢查的目標(biāo)物質(zhì)，尤其是多個(gè)腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)可以極大地提高早期診斷率。同時(shí)，腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)還能夠?yàn)槟[瘤患者個(gè)體化治療方案的建立提供幫助。然而，目前臨床開展的此類實(shí)驗(yàn)技術(shù)大都是單指標(biāo)的分析方法，如果將其應(yīng)用于人群惡性腫瘤的篩查，不僅成本高昂，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不易推廣。液相芯片技術(shù)是20世

3、紀(jì)末問世的一種多元分析技術(shù)，它由基因芯片技術(shù)演變而來，具備高通量的特性，并且方法靈敏度高，特異性好，是應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的理想分析技術(shù)。
　　液相芯片主要由編碼微球、探針分子、目標(biāo)分子、報(bào)告分子四個(gè)部分組成，最初的編碼微球以熒光編碼為主，最具代表性的是Luminex公司商業(yè)化的xMAP技術(shù)。但是熒光編碼存在易于淬滅并導(dǎo)致編碼丟失或者誤編碼的問題。因此，多年來研究人員一直在尋找一種熒光編碼的替代方案。2002年，多孔硅光子晶體薄膜

4、首次被提出作為生物分子篩查的基底。2006年，具有三維結(jié)構(gòu)的自組裝光子晶體微球首次被制作出并應(yīng)用于液相芯片的載體進(jìn)行多元生物分子檢測(cè)。
　　本論文探討了以光子晶體編碼微球作為載體的液相芯片技術(shù)在腫瘤標(biāo)志物多元分析中的應(yīng)用，工作主要分為三個(gè)部分，其內(nèi)容與創(chuàng)新點(diǎn)如下:
　　一、基于二氧化硅光子晶體微球陣列的腫瘤多藥耐藥基因表達(dá)情況的多元分析。應(yīng)用可控的多元PCR技術(shù)對(duì)篩選出的多藥耐藥基因1(multidrug resistanc

5、e1gene，MDR1)和多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multidrug resistance-associated protein1，MRP1)兩段目標(biāo)基因的特征性片段進(jìn)行擴(kuò)增，以反應(yīng)條件優(yōu)化后的基于雙探針雜交反應(yīng)的二氧化硅光子晶體微球陣列對(duì)擴(kuò)增后的特征性片段進(jìn)行定量分析，通過分析結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)熒光濃度曲線的比對(duì)獲得目標(biāo)基因的起始濃度，從而建立了一種可用于基因表達(dá)情況分析的多元分析技術(shù)。這種多元分析技術(shù)操作簡(jiǎn)便，成本低廉。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的信號(hào)放大技術(shù)

6、是常用的PCR擴(kuò)增技術(shù)，但是為了保證擴(kuò)增后的終產(chǎn)物與起始濃度的相關(guān)性，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)目受到嚴(yán)格的控制，成為可控PCR擴(kuò)增。這樣的信號(hào)放大策略是在以前的文獻(xiàn)報(bào)道中從未出現(xiàn)過的。
　　二、基于復(fù)合材料光子晶體微球陣列芯片的快速、多元腫瘤蛋白標(biāo)志物分析。通過第一部分實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單純的二氧化硅光子晶體微球在檢測(cè)中存在諸多問題，想要建立重復(fù)性更好的檢測(cè)方法首先必須對(duì)微球載體進(jìn)行針對(duì)性的創(chuàng)新優(yōu)化、改造升級(jí)。因此，二氧化硅和水凝膠復(fù)合材料光子晶體微球被

7、開發(fā)出來。這兩種材料互相彌補(bǔ)了對(duì)方的不足之處，同時(shí)使得微球保有二氧化硅微球和水凝膠微球各自的優(yōu)點(diǎn)。之后，基于此種復(fù)合材料微球的多元檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方案也得到了確立，使得光子晶體微球陣列的檢測(cè)靈敏度得到極大的增強(qiáng)。同時(shí)，為了方法最終能夠標(biāo)準(zhǔn)化，配套的盒式芯片裝置也被開發(fā)出來應(yīng)用于增強(qiáng)方法的可操作性和重復(fù)性。
　　三、基于反蛋白石結(jié)構(gòu)水凝膠光子晶體微球陣列的超敏蛋白檢測(cè)。隨著蛋白組學(xué)研究的推進(jìn)，更多、更靈敏且特異性更好的腫瘤標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，例如

8、胃泌素釋放肽前體(Pro-Gastrin-Releasing Peptide，ProGRP)對(duì)于小細(xì)胞肺癌的診斷具有很高的靈敏度和器官特異性。ProGRP在血清中的含量極低，達(dá)到pg/ml的數(shù)量級(jí)。因此，未來惡性腫瘤篩查工作所應(yīng)用的檢測(cè)技術(shù)必須同時(shí)滿足高靈敏度檢測(cè)和多元檢測(cè)的條件?？墒牵壳伴_展的實(shí)驗(yàn)室分析技術(shù)多為單指標(biāo)分析技術(shù)，應(yīng)用于惡性腫瘤篩查費(fèi)時(shí)費(fèi)力?；诜吹鞍资Y(jié)構(gòu)水凝膠光子晶體微球陣列的液相芯片技術(shù)可以達(dá)到新一代標(biāo)志物的檢測(cè)靈

9、敏度，同時(shí)也能進(jìn)行多元分析，是一種理想的可用于人群篩查的檢測(cè)方法。該方法以反蛋白石結(jié)構(gòu)的水凝膠光子晶體微球作為載體，充分利用了微球在反應(yīng)過程中發(fā)生溶脹，反應(yīng)結(jié)束后在高濃度乙醇的作用下發(fā)生脫水而回縮的特性，不僅完成了檢測(cè)信號(hào)的放大，提高了檢測(cè)靈敏度，同時(shí)解決了水凝膠微球在反應(yīng)液中發(fā)生溶脹而丟失編碼的問題?；诿?xì)管微流控實(shí)驗(yàn)裝置的搭建進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和操作簡(jiǎn)便性。
　　隨著對(duì)光子晶體編碼微球芯片的研究不斷深入，它的潛在應(yīng)用價(jià)