馬爾尼菲青霉致病性與宿主細(xì)胞激活誘導(dǎo)凋亡的相關(guān)性研究.pdf

1、一、研究背景: 馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei，PM)，屬真菌界，半知菌亞門(mén)，絲孢菌綱，絲孢目，青霉屬，雙輪青霉亞屬，青霉種。馬爾尼菲青霉感染人體后引起的一種嚴(yán)重的深部真菌病——馬爾尼菲青霉病(Penicilliosis marneffei，PMS)。多在中國(guó)東南部、泰國(guó)、馬來(lái)西亞、新加坡等國(guó)家及我國(guó)的香港、臺(tái)灣地區(qū)，偶在印度有病例報(bào)道，主要是感染免疫力低下的人群。馬爾尼菲青霉在感染機(jī)體后，通常呈隱匿發(fā)

2、病，臨床表征成多樣性如發(fā)熱、貧血、淋巴結(jié)炎、肝脾腫大及皮膚軟疣樣皮疹等，且馬爾尼菲青霉常引起AIDS患者及免疫力低下人群的嚴(yán)重感染，因此人們開(kāi)始逐漸重視馬爾尼菲青霉病的傳播途徑。 馬爾尼菲青霉菌是青霉屬300多種青霉菌中唯一的雙相型真菌，25℃生長(zhǎng)為菌絲相，以無(wú)性孢子的方式繁殖；37℃則呈酵母相，以無(wú)絲分裂的方式繁殖。竹鼠是馬爾尼菲青霉的自然宿主，但傳播給人類(lèi)的機(jī)制尚未明了清楚。目前認(rèn)為馬爾尼菲青霉菌感染人體的可能途徑是為孢子經(jīng)

3、呼吸道侵入宿主體內(nèi)，馬爾尼菲青霉菌的分生孢子與支氣管上皮細(xì)胞的糖蛋白產(chǎn)生黏附后，肺泡的巨噬細(xì)胞將之吞噬，但馬爾尼菲青霉酵母細(xì)胞能在巨噬細(xì)胞免疫系統(tǒng)壓力、氧耗壓力及營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下啟動(dòng)相關(guān)基因，編碼一系列毒力因子而有利于其在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存不被殺滅。分生孢子在人體37℃的環(huán)境下會(huì)發(fā)生雙相型轉(zhuǎn)變產(chǎn)生致病性的酵母相細(xì)胞，并存在于宿主的巨噬細(xì)胞內(nèi)，隨著巨噬細(xì)胞游走播散至全身各個(gè)器官。 宿主對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)病原體的重要免疫反應(yīng)途徑是通過(guò)固有免疫和

4、適應(yīng)性免疫。固有免疫是機(jī)體抵抗異物及病原的第一道防線，參與啟動(dòng)、調(diào)節(jié)、協(xié)同適應(yīng)性免疫共同清除感染的病原體達(dá)到抗感染目的。固有免疫的效應(yīng)細(xì)胞主要有中性粒細(xì)胞、單核—巨噬細(xì)胞等。但馬爾尼菲青霉酵母相不但具有抵抗宿主免疫系統(tǒng)消滅的能力，而且能存活于宿主的巨噬細(xì)胞內(nèi)，在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的馬爾尼菲青霉繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，并隨巨噬細(xì)胞游走播散，造成系統(tǒng)性真菌病。 馬爾尼菲青霉作為一種胞內(nèi)寄生菌是如何逃避宿主免疫防衛(wèi)機(jī)制的，尚有待進(jìn)一步研究。宿主細(xì)胞

5、可以與細(xì)胞內(nèi)病原體反應(yīng)產(chǎn)生凋亡，這是一種控制感染的機(jī)制。但也有一些微生物如肺炎衣原體、結(jié)核分枝桿菌能抑制凋亡，這是病原體在宿主細(xì)胞內(nèi)生存和繁殖的策略。由此我們推論受感染的宿主細(xì)胞凋亡情況對(duì)于寄生于其中的馬爾尼菲青霉的命運(yùn)至關(guān)重要。了解馬爾尼菲青霉能否誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡狀態(tài)改變可能是理解馬爾尼菲青霉致病機(jī)制的重要基礎(chǔ)，也可能為發(fā)展新的抗真菌治療、免疫干預(yù)策略提供切入點(diǎn)。 二、研究目的: 1.本課題擬在研究宿主細(xì)胞感染馬爾尼菲

6、青霉后細(xì)胞凋亡、凋亡途徑與該菌胞內(nèi)寄生的相關(guān)性。 2.了解宿主與馬爾尼菲青霉間相互作用，以期進(jìn)一步闡述馬爾尼菲青霉的發(fā)病機(jī)制，為發(fā)展真菌病生物治療、免疫干預(yù)策略提供重要理論基礎(chǔ)。 三、實(shí)驗(yàn)對(duì)象與方法: 1.標(biāo)本來(lái)源：分離自我科病人的馬爾尼菲青霉臨床株SUMS0152，37℃誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變成酵母相，收集酵母相菌株。 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/c雌性5～8周小鼠，體重為20～25g之間，購(gòu)自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心

7、。 3.實(shí)驗(yàn)分組：以不同時(shí)間4h、36h各分成空白對(duì)照組(PBS組)、實(shí)驗(yàn)組(馬爾尼菲青霉組)。每組6只小鼠。 4.實(shí)驗(yàn)方法： 1)用瑞式染色進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)及計(jì)數(shù)。 2)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4h、36h的小鼠腹腔細(xì)胞凋亡率。 3) RT—PCR法測(cè)定Capase—3、Fas、Bcl—2、Mcl-1的mRNA水平。 5.統(tǒng)計(jì)分析：計(jì)數(shù)炎癥細(xì)胞比例采用卡方檢驗(yàn)。依4h、36h實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組的細(xì)

8、胞凋亡及不同凋亡因子的mRNA表達(dá)水平采用隨機(jī)分組t—檢驗(yàn)分析。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。全部統(tǒng)計(jì)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析和Office2003軟件在計(jì)算機(jī)上完成。 四、結(jié)果: 1.用瑞式染色后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以計(jì)算啟動(dòng)炎癥細(xì)胞的情況，結(jié)果表明在4h、36h時(shí)，有經(jīng)馬爾尼菲青霉刺激的小鼠的固有免疫效應(yīng)細(xì)胞數(shù)比例(中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞)與空白對(duì)照組比較顯著升高(P<0.05)。 2.利用流式細(xì)胞

9、術(shù)檢測(cè)小鼠腹腔內(nèi)的炎癥細(xì)胞，結(jié)果顯示4h、36h均有抑制細(xì)胞凋亡的作用(P<0.05)，4 h實(shí)驗(yàn)組與36h實(shí)驗(yàn)組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 3.經(jīng)小鼠體內(nèi)培養(yǎng)馬爾尼菲青霉4h后的凋亡因子Caspase—3、Fas的mRNA的表達(dá)量較空白對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，36h后實(shí)驗(yàn)組的mRNA表達(dá)量較4h實(shí)驗(yàn)組顯著降低(P<0.05)。經(jīng)小鼠體內(nèi)培養(yǎng)馬爾尼菲青霉4h后的抑制凋亡因子Bcl—2、Mcl-1的mRNA的表達(dá)量較

10、空白對(duì)照組顯著增高(P<0.05)，36h后實(shí)驗(yàn)組的mRNA表達(dá)量較4h實(shí)驗(yàn)組顯著增高(P<0.05)。 五、結(jié)論: 1.馬爾尼菲青霉在4h時(shí)誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞趨化，經(jīng)36h后，炎癥細(xì)胞的趨化并未因機(jī)體的保護(hù)性免疫反應(yīng)的發(fā)生而下降，表示馬爾尼菲青霉可能為了生存而演化出抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制。 2.在不同時(shí)間(4h、36h)下小鼠腹腔炎癥細(xì)胞的凋亡率均下降，但兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)間的凋亡率并無(wú)明顯分別。表