曲霉和馬爾尼菲氏青霉多糖蛋白檢測方法的研究.pdf

1、背景及目的：
　　 侵襲性真菌感染是因機體免疫力下降引發(fā)的嚴重的播散性真菌感染。近30年來，隨著繼發(fā)性免疫功能低下(如白細胞減少癥、燒傷、器官移植、HIV感染等)人群的增多、免疫抑制劑、抗腫瘤藥物及廣譜抗生素的大量使用、導(dǎo)管置管的廣泛開展等，機會性真菌感染呈明顯的上升趨勢，較為突出的有2種真菌：曲霉(Aspergillus spp.)和馬爾尼菲氏青霉(Penicillium marneffei)。發(fā)病率主要與病人的免疫力狀態(tài)和暴

2、露于危險因素(如環(huán)境中高濃度的真菌污染等)的程度有關(guān)。曲霉廣泛分布于環(huán)境中，種類繁多，有200種左右，是家居環(huán)境和糧食、食品中最常見的污染真菌，嚴重影響人類健康。其中10種以上可以引起人類疾病，常見為煙曲霉和黃曲霉，少見的有土曲霉、黑曲霉和構(gòu)巢曲霉等，臨床上表現(xiàn)為過敏性疾病和致死性的侵襲性曲霉病。而青霉中唯一的溫度依賴性雙相真菌--馬爾尼菲氏青霉，主要引起AIDS患者和免疫力低下人群的感染。自1956年分離于越南的竹鼠以來，在東南亞國家

3、如泰國、印度北部、我國南方省份(如廣東、廣西、香港、臺灣)、越南等感染病例的報道逐年增加，呈明顯地域性，尤其在HIV感染高發(fā)區(qū)，馬爾尼菲氏青霉的感染率也明顯升高。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，馬爾尼菲氏青霉已經(jīng)成為東南亞國家AIDS患者中并發(fā)機會性感染的主要致病菌之一。上述兩種真菌所導(dǎo)致的侵襲性感染，如侵襲性曲霉病和播散性馬爾尼菲氏青霉病，病情急重，死亡率極高，據(jù)報道已經(jīng)超過50％，主要原因是：(1)缺乏早期、準確的診斷；(2)抗真菌藥物的毒副作用

4、嚴重且耐藥株不斷增多。
　　 為降低感染病人的死亡率，迅速、快捷、準確的診斷對預(yù)后尤為重要。但系統(tǒng)性的機會性真菌感染多發(fā)生于免疫功能嚴重受損的病人，缺乏特異性臨床表現(xiàn)，因此，須依賴實驗室手段進行確診。目前實驗室診斷真菌感染的方法主要有：真菌培養(yǎng)、分子生物學(xué)技術(shù)、組織學(xué)檢查和血清學(xué)診斷。(1)真菌培養(yǎng)是真菌感染實驗室診斷的金標準，但是耗時長，周期一般4周左右。(2)雖然分子生物學(xué)方法更靈敏快速，但是需要特殊的實驗室儀器設(shè)備和操作技

5、術(shù)，并較易發(fā)生污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果；而且環(huán)境中廣泛存在的曲霉也為分子生物學(xué)檢測增加了難度。(3)組織學(xué)檢查雖然快速，但對免疫功能嚴重受損的患者而言創(chuàng)傷性極大。(4)血清學(xué)診斷則成為早期診斷真菌感染的一種合理選擇。但是，由于曲霉廣泛存在于周圍環(huán)境中，每人每天至少吸入幾百個漂浮于空氣中的曲霉孢子，幾乎每個健康成年人血清中均含有較高濃度的曲霉特異性抗體；血清中抗體的檢測還受限于患者在嚴重免疫抑制狀態(tài)下，無法產(chǎn)生足夠的抗體。所以，特異性抗體檢測對

6、曲霉感染的早期診斷意義不大。雖然部分馬爾尼菲氏青霉感染患者中存在特異性抗體，但研究發(fā)現(xiàn)特異性抗體的檢出率并不高，而且在伴有馬爾尼菲氏青霉感染的AIDS患者中，特異性抗原升高的水平較抗體更明顯。因此，尋找特異性抗原，尤其是循環(huán)抗原，將有助于曲霉及馬爾尼菲氏青霉感染的早期診斷，并可能用于HIV感染的輔助診斷。
　　 目前真菌感染早期診斷的靶標集中在真菌細胞壁成分，尤其是多糖成分。多糖(或多糖蛋白)是構(gòu)成真菌細胞壁的骨架結(jié)構(gòu)，也是細胞

7、壁上的主要抗原成分，其中甘露聚糖(或甘露聚糖蛋白)含量最高。有研究發(fā)現(xiàn)曲霉病人血清中存在高水平的循環(huán)半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)，并以此為靶標建立的雙夾心曲霉抗原檢測試劑盒(Platelia Aspergillus)，在曲霉病的早期診斷中有重要價值。但檢測青霉素類抗生素(例如：氨芐西林-舒巴坦，哌拉西林-三唑巴坦，阿莫西林-克拉維酸)治療的免疫抑制病人標本時，該試劑盒的假陽性率很高，這是由于GM抗原還同時存在于其它真

8、菌如青霉細胞壁中，從而導(dǎo)致臨床誤診，進行不必要的抗真菌治療。而馬爾尼菲氏青霉感染卻缺乏特異、靈敏的早期診斷試劑盒。因此，本研究旨在建立一種能夠特異性檢測并區(qū)分曲霉和馬爾尼菲氏青霉感染的免疫學(xué)方法。
　　 方法及結(jié)果：
　　 本研究主要包括三部分內(nèi)容：
　　 第一部分：曲霉屬和煙曲霉特異性多糖蛋白檢測方法的研究。
　　 本實驗室前期研究用煙曲霉提取曲霉多糖蛋白和特異性位于煙曲霉細胞壁和分泌上清中的重組甘露聚

9、糖蛋白(命名為Afmplp)，分別免疫小鼠并制備針對曲霉多糖蛋白的單克隆抗體和針對Afmplp的單克隆抗體，分別以這兩組單抗配對建立兩種雙抗體夾心ELISA抗原捕獲法。本研究進一步探討這兩種檢測方法對曲霉多糖蛋白的特異性和廣譜性。用這兩種曲霉多糖蛋白檢測方法對多種環(huán)境曲霉和臨床曲霉培養(yǎng)上清進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用煙曲霉提取多糖蛋白免疫制備單抗建立的檢測方法可廣譜性檢測臨床、環(huán)境中的多種曲霉；而煙曲霉Afmplp單抗建立的檢測方法僅特異性檢

10、測臨床和環(huán)境中的煙曲霉。且這兩種檢測方法與其它真菌(1株馬爾尼菲氏青霉及5株念珠菌)均無交叉反應(yīng)，提示兩種方法分別為曲霉屬廣譜性和煙曲霉特異性檢測方法。
　　 上述結(jié)果表明，這兩種檢測方法除可用于早期診斷曲霉感染，特別是煙曲霉感染，還可用于廣譜檢測污染環(huán)境、農(nóng)作物、食品中的多種曲霉，為早期診斷曲霉病和監(jiān)測環(huán)境、農(nóng)作物、食品中的曲霉污染提供新的技術(shù)手段。
　　 第二部分：馬爾尼菲氏青霉多糖蛋白單克隆抗體和免疫兔血清的制備及

11、鑒定。
　　 研究初步證實甘露聚糖蛋白也存在于馬爾尼菲氏青霉感染患者血清中，因此可以作為早期診斷的靶標。本研究用一種從馬爾尼菲氏青霉cDNA文庫中克隆的甘露聚糖蛋白(命名為Mplp)為免疫原，通過畢赤酵母系統(tǒng)表達該重組Mplp多糖蛋白并免疫小鼠，取抗體效價高的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，經(jīng)重組Mplp蛋白和間接免疫熒光法篩選強陽性克隆，最終獲得18株穩(wěn)定分泌Mplp蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株。免疫球蛋白亞類鑒定18株單克

12、隆抗體，10株為IgG1，3株為IgG2a，3株為IgG2b，2株為IgG。采用相互競爭抑制試驗分析單克隆抗體識別抗原表位，結(jié)果顯示18株單克隆抗體至少識別4個不同的抗原位點。
　　 同時用Mplp重組多糖蛋白免疫新西蘭大白兔，獲得了高效價免疫兔血清，抗體滴度達到1×10-7血清稀釋度。免疫印跡和間接免疫熒光鑒定18株單克隆抗體和免疫兔血清，顯示：18株單克隆抗體和免疫兔血清均僅與馬爾尼菲氏青霉酵母相細胞產(chǎn)生陽性反應(yīng)，但不結(jié)合菌

13、絲相細胞；與環(huán)境中常見的其它3種青霉及4種臨床曲霉均無交叉反應(yīng)。
　　 通過對18株針對Mplp單克隆抗體和免疫兔血清免疫學(xué)特性的研究、抗體識別抗原位點的分析以及特異性的鑒定，其結(jié)果顯示這組抗體可用于建立馬爾尼菲氏青霉抗原檢測方法。
　　 第三部分：馬爾尼菲氏青霉多糖蛋白檢測方法的建立及優(yōu)化。
　　 采用雙抗體夾心ELISA法，根據(jù)單克隆抗體識別不同的抗原表位，18株單克隆抗體和兔多抗之間進行互相配對，通過檢測馬

14、爾尼菲氏青霉培養(yǎng)上清、超聲上清及重組Mplp多糖蛋白的靈敏度和特異性，經(jīng)反復(fù)多次篩選，最終確定了以單克隆抗體IF53A7和3C10A9-Biotin組合用于構(gòu)建檢測方法。經(jīng)方陣滴定法確定，包被抗體濃度為10μg/ml，生物素標記抗體工作濃度為1:500。建立的雙抗體夾心抗原捕獲法檢測重組Mplp蛋白的靈敏度為31pg/ml。用該方法進一步檢測其它青霉培養(yǎng)上清，結(jié)果均為陰性。
　　 以上結(jié)果表明，采用抗體夾心抗原捕獲法建立的Mpl

15、p多糖蛋白檢測方法具有很高的靈敏性和特異性，可為馬爾尼菲氏青霉感染提供一種新的實驗室診斷方法。
　　 結(jié)論：
　　 綜合以上三部分的研究結(jié)果，本研究的結(jié)論如下：
　　 一、利用兩組單克隆抗體成功建立可分別特異性檢測煙曲霉和廣譜檢測曲霉屬的免疫學(xué)方法，為曲霉病早期診斷和環(huán)境、農(nóng)作物、食品中污染曲霉的監(jiān)測提供新的技術(shù)手段。
　　 二、成功制備了多株具有馬爾尼菲氏青霉酵母相細胞抗原特異性的單克隆抗體，為免疫診斷

16、試劑的研制、馬爾尼菲氏青霉多糖蛋白生物學(xué)特性的研究以及開發(fā)馬爾尼菲氏青霉治療性抗體等奠定基礎(chǔ)。
　　 三、率先建立靈敏度高、特異性強的雙單克隆抗體夾心馬爾尼菲氏青霉多糖蛋白捕獲ELISA法，該方法特異性針對馬爾尼菲氏青霉酵母相細胞抗原，與其它青霉及曲霉均無交叉，有望用于馬爾尼菲氏青霉感染的早期診斷。
　　 四、利用甘露聚糖蛋白為靶標，成功的建立了區(qū)別檢測曲霉和馬爾尼菲氏青霉的方法，為特異性診斷曲霉和馬爾尼菲氏青霉感染奠定