馬爾尼菲青霉生物學(xué)特性研究及其差異表達(dá)基因的篩選和鑒定.pdf

1、馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei，PM)，屬真菌界，半知菌亞門，絲孢菌綱，絲孢目，青霉屬，雙輪青霉亞屬。馬爾尼菲青霉感染人體后引起的一種嚴(yán)重的深部真菌病——馬爾尼菲青霉病(Penicilliosis marneffei，PSM)。自DiSalvo首例報(bào)道之后，此真菌感染導(dǎo)致的疾病開始逐漸引起人們的重視。該病的發(fā)生有一定地域性，在艾滋病流行以前，較為罕見，主要在東南亞地區(qū)如泰國、越南、柬埔寨、老撾、香港和我國廣西等

2、地。近20年來隨著免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用、器官移植、AIDS等所導(dǎo)致的免疫缺陷宿主不斷增多，馬爾尼菲青霉病的報(bào)道也日漸增多，而且發(fā)病區(qū)域有擴(kuò)大趨勢。僅廣州已發(fā)現(xiàn)馬爾尼菲青霉病例近百余例，其中約50﹪以上與AIDS相關(guān)，已成為繼廣西省之后我國第二大馬爾尼菲青霉病的重要流行區(qū)域。由于該病發(fā)病隱匿，病死率高達(dá)80﹪以上，并與AIDS高度相關(guān)，危害極大，所以已引起國內(nèi)外真菌專家的重視。 馬爾尼菲青霉是青霉屬300多種青霉中唯一的雙相型真菌

3、，25℃生長為菌絲相，以無性孢子的方式繁殖；37℃則呈酵母相，以分裂的方式繁殖，至今未發(fā)現(xiàn)它的有性生殖期。馬爾尼菲青霉的自然宿主為竹鼠及其洞穴周圍的土壤，但它如何從自然界傳播給人類尚未清楚。目前認(rèn)為馬爾尼菲青霉感染人體的可能的途徑為孢子經(jīng)呼吸道進(jìn)入宿主，然后在人體37℃的環(huán)境下發(fā)生雙相型轉(zhuǎn)變產(chǎn)生致病性的酵母細(xì)胞，在免疫缺陷患者中侵范單核-巨嗜細(xì)胞系統(tǒng)并引起播散。在馬爾尼菲青霉雙相型轉(zhuǎn)換中有以下兩點(diǎn)是值得關(guān)注的，其一，在溫度的誘導(dǎo)下，其酵

4、母相與菌絲相之間可以兩種形態(tài)相互轉(zhuǎn)換，既可以從菌絲向酵母轉(zhuǎn)換，也可以從酵母向菌絲轉(zhuǎn)換。其二，分生孢子從呼吸道侵入宿主，肺泡巨噬細(xì)胞將之吞噬，分生孢子直接轉(zhuǎn)變?yōu)榻湍讣?xì)胞，并沒有經(jīng)歷從分生孢子出芽形成菌絲的過程。這些說明馬爾尼菲青霉雙相型轉(zhuǎn)換受一系列溫度變化開啟的基因調(diào)控，其在體內(nèi)的致病形式為酵母細(xì)胞，但具體的調(diào)控機(jī)制和毒力基因尚不明確。已有研究表明馬爾尼菲青霉的致病性與其雙相型轉(zhuǎn)變密切相關(guān)。這兩種生長形態(tài)的改變可以使一些基因的表達(dá)水平發(fā)生

5、改變，以調(diào)節(jié)馬爾尼菲青霉細(xì)胞的分化及形態(tài)的轉(zhuǎn)變。一些有可能在雙相型轉(zhuǎn)變中起關(guān)鍵作用基因被詳細(xì)的研究，如abaA基因，cflA(CDC42 homolog)基因和TupA基因等，這些研究對其形態(tài)形成的分子機(jī)制具有一定的提示作用，但尚未發(fā)現(xiàn)對雙相型轉(zhuǎn)換起直接調(diào)控作用的基因。所以全面而細(xì)致的尋找馬爾尼菲青霉雙相間的差異性表達(dá)基因有可能為揭開馬爾尼菲青霉形態(tài)轉(zhuǎn)變的秘密及進(jìn)一步尋找其致病相關(guān)基因提供一些幫助。 抑制消減雜交技術(shù)(suppr

6、ession subtractive hybridization，SSH)主要通過消減雜交將待比較雙方共同的cDNA進(jìn)行消減，再通過抑制性PCR技術(shù)擴(kuò)增在Tester中特異表達(dá)的cDNA片段，使其得到大量富集。抑制性消減雜交技術(shù)是當(dāng)今研究基因差異表達(dá)最為有效的工具之一。迄今為止，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于腫瘤、植物及致病真菌等的研究中。 本課題以馬爾尼菲青霉的雙相性轉(zhuǎn)換為切入點(diǎn)，除了介紹馬爾尼菲青霉的生物學(xué)特性及分子生物學(xué)鑒定方法外，還將

7、SSH技術(shù)應(yīng)用于尋找馬爾尼菲青霉菌絲相與酵母相的差異表達(dá)基因的研究中，為進(jìn)一步尋找其致病相關(guān)基因、探討致病性作一些基礎(chǔ)研究，也希望為馬爾尼菲青霉病的致病機(jī)制深入研究提供一些資料。 第一部分馬爾尼菲青霉生物學(xué)特性研究及分子生物學(xué)鑒定方法。 1.1馬爾尼菲青霉生物學(xué)特性研究馬爾尼菲青霉在五種培養(yǎng)基上的生長情況：將馬爾尼菲青霉菌株SUMS0152、SUMS0050、SUMS0215、SUMS0222接種于SDA、PDA、BHI

8、、CDA、CMA五種不同的培養(yǎng)基上，然后分別放置在25℃和37℃培養(yǎng)兩周。在25℃，四株馬爾尼菲青霉在五種培養(yǎng)基上均生長良好，但在不同培養(yǎng)基上生長速度，色素產(chǎn)生情況，菌落形態(tài)及顯微鏡下形態(tài)有所不同。在37℃，馬爾尼菲青霉均生長為酵母狀菌落，無色素產(chǎn)生，但在不同的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化為酵母細(xì)胞的能力不同。馬爾尼菲青霉在SDA培養(yǎng)基上不同溫度下的生長情況：四株馬爾尼菲青霉在6℃和10℃菌落生長減慢，產(chǎn)生色素減少，18℃及28℃生長良好，產(chǎn)生大量紅色

9、色素。在37℃為酵母狀菌落，生長較快，但容易死亡，在40℃未發(fā)現(xiàn)生長。 放線菌酮耐受試驗(yàn)：四株馬爾尼菲青霉在含有放線菌酮(濃度0.1﹪，0.05﹪)的SDA培養(yǎng)基上25℃和37℃均未見生長，在含0.01﹪放線菌酮的培養(yǎng)基上緩慢生長。 尿素酶產(chǎn)生情況：四株馬爾尼菲青霉在37℃的尿素酶試驗(yàn)均為陰性。 1.2馬爾尼菲青霉的ITS序列測定采用來源于真菌核糖體大亞基基因保守區(qū)的通用引物ITS5和ITS4，PCR擴(kuò)增四株馬爾

10、尼菲青霉的rDNAITS區(qū)。四株馬爾尼菲青霉的均能擴(kuò)增出600bp左右的片段，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，序列在Genbank中應(yīng)用Blastn進(jìn)行查詢，所有菌株均與馬爾尼菲青霉的標(biāo)準(zhǔn)株具有100﹪同源性。ITS序列分析是一種快速、準(zhǔn)確的鑒定馬爾尼菲青霉的分子生物學(xué)方法。 第二部分馬爾尼菲青霉抑制性消減文庫的建立。 1.1馬爾尼菲青霉總RNA提取方法的比較利用Rneasy Plant Mini Kit，Trizol，改良的異硫

11、氰酸胍法，RNAex四種方法提取馬爾尼菲青霉雙相的總RNA，以尋找一種合適的方法用于建立抑制性消減文庫。結(jié)果顯示四種方法提取的RNA均較為完整，但相同重量的菌體所提取的RNA產(chǎn)量、質(zhì)量及所用時(shí)間和價(jià)格皆有差異。通過比較，發(fā)現(xiàn)Trizol提取的RNA具有完整性和純度均較好，產(chǎn)量較高，操作相對簡便，價(jià)格適中等優(yōu)點(diǎn)，可用于有效的建立抑制性消減文庫。 1.2馬爾尼菲青霉抑制性消減文庫的建立利用SMART技術(shù)將馬爾尼菲青霉菌絲相和酵母相的

12、總RNA合成cDNA并進(jìn)行Rsal酶切。然后應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)，連接不同的接頭，通過兩輪雜交和兩次抑制性PCR后，將產(chǎn)物與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)染大腸桿菌。經(jīng)PCR鑒定，共得到1200余條插入片段。成功構(gòu)建了馬爾尼菲青霉的正向消減文庫(以酵母相為tester，菌絲相為driver)和反向消減文庫(以菌絲相為tester，,酵母相為driver)。 第三部分馬爾尼菲青霉差異表達(dá)基因的篩選及初步功能研究。

13、從馬爾尼菲青霉正向消減文庫和反向消減文庫選取500個(gè)cDNA片段進(jìn)行cDNA斑點(diǎn)雜交。共在正向文庫中篩選出46個(gè)陽性克隆，反向文庫中篩選出35個(gè)陽性克隆。經(jīng)測序分析及Blastx查詢，這些基因按其功能可以分為細(xì)胞壁合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞循環(huán)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、基礎(chǔ)代謝、應(yīng)激反應(yīng)等幾大類。應(yīng)用相對定量real-time PCR寸六個(gè)代表性基因進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。我們推測在溫度改變時(shí)，馬爾尼菲青霉的信號傳導(dǎo)通路被開啟，相應(yīng)的基因表達(dá)上調(diào)，這些基因決定