豬輪狀病毒GD-01-2015的全基因序列分析及雙夾心ELISA方法的建立.pdf

1、輪狀病毒(Rotavirus，RV)是人畜共患腹瀉的重要病原之一，其中豬輪狀病毒(PorcineRotavirus，PoRV)是仔豬腹瀉的重要病因之一。該病流行范圍廣，發(fā)病率較高，若與豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)混合感染會(huì)使病情加重，導(dǎo)致高死亡率，從而給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本論文就PoRV-GD-01-2015的全基因測(cè)序、抗PoRV的單克隆抗體的制備以及檢測(cè)PoRV的ELISA方法的建立三個(gè)方面展

2、開研究，對(duì)PoRV疫苗的研發(fā)和致病機(jī)理的研究具有重要意義。
　　1.PoRV-GD-01-2015的全基因序列分析
　　本實(shí)驗(yàn)將一份經(jīng)RT-PCR檢測(cè)豬輪狀病毒病原陽性的臨床腹瀉糞樣感染Vero細(xì)胞，成功分離到一株豬輪狀病毒GD-01-2015株;參照已發(fā)表的A組輪狀病毒CC0912-1設(shè)計(jì)合成11對(duì)引物，對(duì)GD-01-2015進(jìn)行全基因克隆測(cè)序，并對(duì)其11個(gè)基因片段進(jìn)行RotaC軟件分析、遺傳變異分析和生物信息學(xué)分析。結(jié)果

3、顯示，GD-01-2015完整基因型為G5-P[7]-I5-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1;GD-01-2015與韓國毒株K5核酸同源性高達(dá)99％;生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)各蛋白都具有良好的抗原性，其中VP1、VP3、VP4、VP7、NSP1、NSP2和NSP4屬于穩(wěn)定蛋白，VP7和NSP4分別含有2個(gè)和1個(gè)跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，且VP7屬于疏水性蛋白。
　　2.抗PoRV的單克隆抗體的制備
　　將研究一中的PoRV-G

4、D-01-2015感染Vero細(xì)胞，并將濃縮的含有PoRV-GD-01-2015的細(xì)胞液作為免疫原免疫小鼠，經(jīng)過兩次融合，以間接免疫熒光(IFA)方法為篩選方法，成功獲得兩株抗PoRV的單克隆抗體，并命名為PoRV-2F10和PoRV-6F5。經(jīng)Western-Blot驗(yàn)證所得單抗只識(shí)別病毒抗原。經(jīng)商品化試劑盒鑒定，所得兩株單克隆抗體的類型均為IgG，Kappa鏈。將兩株單抗制備腹水后，利用Protein G柱獲得了純化的抗體，為后續(xù)建

5、立檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。
　　3.雙夾心ELISA方法的建立
　　通過相加ELISA方法確定PoRV-2F10和PoRV-6F5為針對(duì)不同抗原位點(diǎn)的兩株單克隆抗體。將兩株單克隆抗體進(jìn)行交叉配對(duì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果確定以PoRV-6F5為捕捉抗體，PoRV-2F10為酶標(biāo)抗體建立了檢測(cè)PoRV的雙夾心ELISA方法;通過實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，確定了捕捉抗體和酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度分別為3.5μg/mL和0.25μg/mL，待檢抗原和酶標(biāo)抗體的最

6、佳孵育時(shí)間均為60min，最佳顯色時(shí)間為20min;陽性臨界值的確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)OD450＞0.165時(shí)判為陽性;利用本實(shí)驗(yàn)建立好的雙夾心ELISA方法檢測(cè)PoRV，檢測(cè)到的最低抗原量為1.3×105個(gè)TCID50;交叉反應(yīng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)建立的雙夾心ELISA方法只與PoRV有陽性反應(yīng)，與TGEV和PEDV無交叉反應(yīng)，與陰性Vero細(xì)胞也無交叉反應(yīng)，表明該方法具有較好的特異性;通過批間批內(nèi)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該方法的批內(nèi)和批間的變異