人角朊干細胞的免疫磁珠分選及siRNA干擾其CCL20表達的初步研究.pdf

1、目的： 1．從人包皮組織獲得角朊細胞，將其進行體外無血清培養(yǎng)，探索其體外培養(yǎng)的生長特點。利于免疫磁珠細胞分選法(Magnetic Activated Cell Sorting，MACS)結合人胎盤Ⅳ型膠原粘附法從角朊細胞中分離出角朊干細胞后進行無血清培養(yǎng)，尋求一種理想有效的人角朊干細胞體外分離培養(yǎng)技術。 2．在本課題組前期已經(jīng)成功構建兩種人CCL20基因特異性小干擾RNA(smallinterference RNA，si

2、RNA)重組慢病毒表達載體的基礎上，補充測序鑒定出一種人CCL20基因特異性siRNA重組慢病毒陰性對照載體。同時，將構建的重組慢病毒載體以包裝細胞293FT包裝生產(chǎn)，最后以慢病毒顆粒感染人角朊細胞株HaCaT細胞和角朊干細胞，并初步檢測siRNA對于角朊細胞表達CCL20的干擾效果。 方法 1．按照Dispase酶一胰酶兩步消化法從人包皮組織獲得角朊細胞(Keratinocyte，KC)，以人胎盤Ⅳ型膠原按照5μg/c

3、m<'2>的密度包被培養(yǎng)瓶，將角朊細胞以無血清培養(yǎng)基(defined keratinocyte-serum free medium，DK-SFM)進行體外原代及傳代培養(yǎng)，并觀察其生長形態(tài)變化、克隆形成，并對原代培養(yǎng)的KC中的KSC以細胞表面分子CD49f(整合素α<，6>)、CD71(轉鐵蛋白受體)、CD29(整合素β<,1>)做表型檢測。 2．以免疫磁珠法對KC細胞中的角朊干細胞(keratinocyte stem cells

4、，KSC)進行分選，分析其分選的純度和比例，再結合人胎盤Ⅳ型膠原粘附法將分選所得的細胞進行體外無血清培養(yǎng)，觀察其生長情況及克隆形成。 3．將含有CCCL20-siRNA慢病毒載體重組質粒的大腸桿菌(escherichia coli，E．coli)的菌液以劃線法接種于含有Amp 60μg/ml的LB平板上，篩選出陽性菌落、擴增后提取質粒，進行DNA測序鑒定。 4．重組慢病毒表達載體質粒pHSER-CCL20-siRNA-G

5、FP-SIN、慢病毒包裝質粒Lentipack和慢病毒包膜蛋白質粒Lentienv按照一定比例混合，與轉染試劑jetPEI一同轉染包裝細胞293FT，24h后觀察其熒光表達情況，并分別在48h、72h、96h后，收集含有慢病毒顆粒的培養(yǎng)基上清液，并保存在-80℃。 5．分別將慢病毒顆粒加入至培養(yǎng)至50-60％融合的HaCaT和人角朊干細胞，并設立空白對照組。24 h后，并在所有細胞中加入刺激因子TNF-α、IL-1β和DK-SF

6、M的混合液，使TNF-α和IL-1β的終濃度均為100ng/ml。48h后收集細胞上清液，進行人CCL20的酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked-immuno-sorbent assay，ELISA)，在酶標儀上檢測其OD<,450>值。根據(jù)試劑盒中標準品的濃度-OD<,450>值，求出其擬合曲線和方程，將樣品OD<,450>值代入方程，得到樣品中CCL20的蛋白濃度。比較幾種慢病毒顆粒和對照組的CCL20濃度，初步評價siRN

7、A干擾對于TNF-α和IL-1β共同刺激下的人角朊細胞株HaCaT和角朊干細胞表達CCL20的下調作用。 結果 1．角朊細胞以無血清培養(yǎng)基可在體外穩(wěn)定培養(yǎng)35.13±7.59天，傳3.87±0.83代，原代細胞克隆形成時間為5.75±0.90天。原代與傳代細胞的克隆形成時間和傳代時間差異不明顯(P>0.05)，細胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后細胞數(shù)無明顯增加。 2．CD49f、CD71直接免疫熒光雙重標記的原代培養(yǎng)角朊細胞中CD

8、49f<'bri> CD71<'dim>細胞的比例為46.6±2.1％，CD29直接免疫熒光標記原代培養(yǎng)角朊細胞的陽性率為65.8±2.3％。 3．新鮮的人角朊細胞懸液經(jīng)MACS法分選后所得的CD49f<'bri> CD71<'dim>細胞比率達(12.2±7.1)％。CD49f<'bri> CD71<'dim>細胞經(jīng)培養(yǎng)可見細胞為典型的上皮樣特征，呈鋪路石樣形態(tài)，高核漿比例，細胞緊密排列，輪廓清楚，折光性好，并可在5-7天左右

9、可形成全克隆，符合角朊干細胞的特點。 4．構建的1種重組慢病毒陰性對照載體通過測序驗證載體構建成功。 5．成功利用293FT細胞包裝已經(jīng)構建成功的重組載體質粒，生產(chǎn)出慢病毒顆粒，觀察到其有較高的感染效應。慢病毒顆粒感染HaCaT和角朊干細胞后通過人CCL20酶聯(lián)免疫吸附測定實驗，初步觀察到兩種人CCL20基因特異性siRNA重組慢病毒表達載體對于人角朊細胞表達CCL20有一定的下調作用。 結論 1．對人K

10、C的體外無血清培養(yǎng)方法進行了觀察，探索出了其體外無血清培養(yǎng)的生長特性和規(guī)律。 2．將MACS分選法與人胎盤Ⅳ型膠原粘附法相結合從皮膚組織的表皮細胞懸液中直接分離出較高比例的干細胞，在如何對KSC進行大量純化的方法學上做了一次新的探索，為后續(xù)研究提供了新的備選技術路線。 3．補充測序驗證成功了1種人CCL20基因特異性siRNA重組慢病毒陰性對照載體。 4．以TNF-α和IL-1β共同刺激感染了CCL20-siRN