CCL20基因修飾人角質(zhì)形成細(xì)胞的克隆篩選及相關(guān)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的研究.pdf

1、減輕同種異體皮膚排斥反應(yīng)、延長(zhǎng)燒傷創(chuàng)面移植物的存活時(shí)間是大面積燒傷治療亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。郎格罕斯細(xì)胞(LC)是引起異基因皮膚移植排斥反應(yīng)的啟動(dòng)細(xì)胞。CCL20主要由活化的角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生,是誘導(dǎo)CD34+造血干細(xì)胞來(lái)源的LC前體向表皮遷移的強(qiáng)有力的趨化因子。抑制CCL20基因在角質(zhì)形成細(xì)胞的表達(dá)可以減少受者的LC向異基因組織工程皮膚內(nèi)遷移,削弱間接抗原提呈途徑,從而減輕受者對(duì)皮膚移植物的排斥反應(yīng)。人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系(HaCaT

2、)不僅具有與表皮干細(xì)胞相似的表型、增殖和分化特性,而且其遺傳特性穩(wěn)定、不具有成瘤性,可作為組織工程皮膚種子細(xì)胞的理想候選者。若能對(duì)HaCaT的CCL20基因進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定的修飾(敲除或干擾),則可能達(dá)到改良組織工程皮膚種子細(xì)胞的目的。因此,本研究擬構(gòu)建CCL20基因敲除的置換型打靶載體,將打靶載體DNA與人角質(zhì)形成細(xì)胞DNA進(jìn)行同源重組,克隆篩選后進(jìn)行鑒定及打靶載體轉(zhuǎn)染方法的探索,并檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在HaCaT及基因敲低型細(xì)胞克隆

3、內(nèi)mRNA的表達(dá)及蛋白水平的變化,為CCL20基因修飾的低排斥反應(yīng)的組織工程皮膚表皮種子細(xì)胞的篩選提供新的理論基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 1.構(gòu)建CCL20基因敲除的置換型打靶載體ploxP-hCCL20,將打靶載體DNA與人角質(zhì)形成細(xì)胞DNA進(jìn)行同源重組,進(jìn)行相關(guān)的鑒定,擬篩選出CCL20基因敲除型細(xì)胞。
　　 2.基于前一部分的研究結(jié)果,構(gòu)建ploxP-hCCL20-EGFP熒光表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)行了分子量較大的打

4、靶載體不同轉(zhuǎn)染方法的探索,觀察了HaCaT細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)情況。
　　 3.在mRNA和蛋白水平上觀察CCL20基因敲低型細(xì)胞克隆內(nèi)干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化,為低排斥反應(yīng)的組織工程皮膚種子細(xì)胞的篩選提供新的理論基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 1.設(shè)計(jì)和合成引物,利用長(zhǎng)距離PCR從HaCaT細(xì)胞基因組DNA中克隆出CCL20基因組DNA片段,再以CCL20基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增帶酶切位點(diǎn)的同源短臂及同源長(zhǎng)臂,分別插入ploxP載體

5、的Neo基因上游和下游,利用T載體及基因克隆技術(shù),構(gòu)建重組質(zhì)粒ploxP-hCCL20置換型打靶載體。
　　 2.將打靶載體經(jīng)EcoRⅠ單酶切線性化后,并以電穿孔方法轉(zhuǎn)染HaCaT,經(jīng)G418及GANC正負(fù)壓力篩選及細(xì)胞培養(yǎng),觀察克隆的形成。
　　 3.在打靶載體的同源短臂的上游及同源長(zhǎng)臂的下游設(shè)計(jì)一對(duì)引物,跨過(guò)Neo基因,以克隆篩選后的HaCaT基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增作PCR鑒定。
　　 4.在人CCL20

6、基因第3外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)同源探針,經(jīng)Primer Premier分析選SacI/KpnI或AccI/KpnI將細(xì)胞基因酶切,作Southern blotting印跡雜交鑒定。
　　 5.pEGFP-N2質(zhì)粒中的啟動(dòng)子CMV IE及EGFP片段克隆至ploxP-hCCL20重組質(zhì)粒中的Asp718及EcoRI酶切位點(diǎn)之間,構(gòu)建ploxP-hCCL20-EGFP熒光表達(dá)質(zhì)粒。
　　 6.將ploxP-hCCL20-EGFP熒光

7、表達(dá)質(zhì)粒以ietPEI脂質(zhì)體及電穿孔聯(lián)合核轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染293FT或HaCaT細(xì)胞,觀察細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)情況并計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。
　　 7.采用流式細(xì)胞術(shù)觀察HaCaT及11株CCL20基因敲低型細(xì)胞克隆(1-2、1-7、1-4、1-3、1-5、2-4、2-6、2-11、2-9、2-10及2-3)內(nèi)干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Sox-2、Nanog、FGF-4、Rex-1及TERT百分率的變化。
　　 8.以GAPDH為內(nèi)標(biāo)

8、,采用熒光定量PCR技術(shù),初步觀察HaCaT及11株克隆細(xì)胞Oct-4、Sox-2及Nanog mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化。
　　 9.以GAPDH為內(nèi)標(biāo),采用熒光定量PCR技術(shù),初步觀察HaCaT、成人包皮角質(zhì)形成細(xì)胞及人羊膜組織Oct-4、Sox-2、Nanog及Rex-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化。
　　 10.根據(jù)初篩結(jié)果,以GAPDH為內(nèi)標(biāo),采用熒光定量PCR技術(shù),對(duì)HaCaT、1-4、1-2、2-9及2-10克

9、隆進(jìn)行Oct-4、Sox-2、Nanog及Rex-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)。
　　 11.以GAPDH為內(nèi)參,采用Western blotting方法,對(duì)HaCaT、1-4、1-2、2-9及2-10克隆進(jìn)行Oct-4、Sox-2、Nanog、Rex-1及TERT蛋白水平的檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1.長(zhǎng)距離PCR從HaCaT細(xì)胞基因組DNA中克隆出CCL20基因組DNA片段(4459bp),獲得帶酶切位點(diǎn)N

10、otI/XhoI的同源短臂(1969bp)及帶酶切位點(diǎn)Xbal/ClaI的同源長(zhǎng)臂(2356bp)。構(gòu)建了針對(duì)人CCL20基因外顯子2的置換型打靶載體ploxP-hCCL20(11.9kb),經(jīng)PCR、雙酶切鑒定正確。將測(cè)序結(jié)果與Genebank中人的CCL20基因全長(zhǎng)序列(NT_005403)相比對(duì),結(jié)果提示:同源短臂有兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異,115位G→A,1274位A→G。同源長(zhǎng)臂有三個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異,2228位T→C,3310位T→A,

11、4208位A→G。發(fā)生變異的堿基均不在外顯子序列上,考慮為單核苷酸多態(tài)性導(dǎo)致。同源短臂中包含了外顯子1及部分內(nèi)含子,同源長(zhǎng)臂包含了外顯子3、4及部分內(nèi)含子。
　　 2.經(jīng)G418及GANC正負(fù)壓力篩選,先后共獲得18個(gè)克隆,用PCR初篩鑒定,顯示為409bp單條帶,表明為野生型。5個(gè)克隆共作了5次Southern印跡雜交,未出現(xiàn)2943bp及4684bp雜合子型所表現(xiàn)的條帶。PCR初篩及Southern印跡雜交均未發(fā)現(xiàn)基因敲除的

12、克隆。
　　 3.電泳及測(cè)序結(jié)果顯示成功構(gòu)建了ploxP－h(huán)CCL20－EGFP熒光表達(dá)質(zhì)粒(13.3 kb)。線性化質(zhì)粒用ietPEI脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,有較強(qiáng)的綠色熒光表達(dá),轉(zhuǎn)染率為75.1％,HaCaT的轉(zhuǎn)染率1.3％。用電穿孔聯(lián)合核轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染HaCaT,陽(yáng)性對(duì)照pmaxGFP的轉(zhuǎn)染率為38.3％,而ploxP-hCCL20-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HaCaT后熒光表達(dá)極少且很弱,轉(zhuǎn)染率為0.3％。
　　 4.Oc

13、t-4及Sox-2雙標(biāo)的流式細(xì)胞術(shù)分析顯示:與HaCaT(94.58±1.08％)相比,11株克隆中2-4克隆Oct-4+Sox-2+表達(dá)的百分率下降,為88.31±1.17％(P=0.040),1.3(69.84±1.17％)和2-11克隆(67.10±1.03％)明顯下降(P＜0.01),2-6及2-9克隆表達(dá)最低,分別為25.51±2.25％和22.95±3.31％(P=0.000;P=0.002),其余克隆無(wú)顯著性差異。

14、　　 5.Nanog、FGF-4、Rex-1及TERT單標(biāo)的流式細(xì)胞術(shù)分析顯示:
　　 6.11株克隆Oct-4、Sox-2及Nanog熒光定量PCR初篩結(jié)果顯示(RQ=2-△△Ct):
　　 7.初步結(jié)果顯示
　　 8.2-9及2-10克隆的熒光定量PCR顯示
　　 9.2-9及2-10克隆的Western blotting結(jié)果顯示
　　 10.1-4及1-2克隆的熒光定量PCR顯示
　

15、　 11.1-4及1-2克隆的Western blotting結(jié)果
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建了針對(duì)人CCL20基因外顯子2的置換型打靶載體ploxP-hCCL20,以此轉(zhuǎn)染HaCaT所獲的18個(gè)克隆經(jīng)PCR和Southern印跡雜交鑒定無(wú)CCL20基因敲除雜合子細(xì)胞克隆。
　　 2.成功構(gòu)建ploxP-hCCL20-EGFP熒光表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)轉(zhuǎn)染HaCaT分析轉(zhuǎn)染效率低下的原因,可能與打靶載體分子量較大和

16、HaCaT難以轉(zhuǎn)染有關(guān),改進(jìn)轉(zhuǎn)染方法有可能獲得基因敲除克隆。
　　 3.11株CCL20基因敲低型細(xì)胞克隆的干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的百分率及mRNA發(fā)生了不同的變化,表明基因修飾干擾了Oct-4、Sox-2、Nanog、FGF-4、Rex-1、TERTmRNA及蛋白水平的表達(dá)。
　　 4.HaCaT的干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Sox-2、Nanog及Rex-1 mRNA表達(dá)量明顯比成人包皮角質(zhì)形成細(xì)胞及羊膜組織低。
　

17、　 5.2-9及2-10克隆與HaCaT相比干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Oct-4、Sox-2、Nanog及TERT蛋白表達(dá)明顯增高,提示這兩個(gè)CCL20基因敲低型克隆的干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子確實(shí)發(fā)生了變化,值得進(jìn)一步探索其發(fā)生的機(jī)制。
　　 6.1-2及1-4克隆表達(dá)Oct-4+Sox-2+、Nanog、Rex-1及TERT的百分率與HaCaT相比無(wú)顯著改變,同時(shí)相應(yīng)的蛋白表達(dá)呈低或極低水平,有可能作為組織工程皮膚種子細(xì)胞的候選者進(jìn)一步研究其細(xì)胞