磁珠分選半相合基因鼠效應(yīng)細(xì)胞免疫治療黑色素瘤的研究.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)以黑色素瘤B16細(xì)胞接種于C57BL/6雌鼠背部，建立小鼠黑色素瘤模型。體外應(yīng)用C57BL/6鼠及半相合基因鼠CB6F1（BABL/C×C57BL/6的雜交子一代，雌性）脾臟來源的樹突狀細(xì)胞負(fù)載腫瘤全抗原與半相合效應(yīng)性淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，隨后檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞體外殺傷黑色素瘤效應(yīng)。然后經(jīng)過磁珠分選純化后富集分泌IFN-γ的半相合效應(yīng)細(xì)胞，將其作用于荷瘤C57BL/6雌鼠體內(nèi)，檢測(cè)純化后的半相合效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤微環(huán)境中炎性因子IL-2及I

2、FN-γ的影響，觀察各組小鼠腫瘤體積變化，生存期，GVHD程度，為腫瘤微環(huán)境干擾介導(dǎo)的細(xì)胞免疫治療技術(shù)在臨床的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，建立C57BL/6小鼠黑色素瘤模型。
　　2.C57BL/6鼠及半相合基因鼠CB6F1來源負(fù)載全腫瘤抗原DC的制備:取C57BL/6、CB6F1小鼠骨髓細(xì)胞，體外貼壁分選后加入rmGM-CSF、rmIL-4、黑色素瘤B16細(xì)胞

3、凍融抗原，TNF-α誘導(dǎo)培養(yǎng)腫瘤抗原致敏的成熟DC(matured DC，mDC)。
　　3.磁珠分選效應(yīng)性T細(xì)胞的制備:將CB6F1小鼠脾細(xì)胞，經(jīng)淋巴分離液分離獲得淋巴細(xì)胞，尼龍毛柱吸附法收集T淋巴細(xì)胞。培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞2天后，加入腫瘤抗原致敏的成熟DC，混合培養(yǎng)3-4天，即可獲得腫瘤抗原刺激后的活化效應(yīng)性T細(xì)胞。應(yīng)用磁珠陽性分選方法富集上述活化半相合基因效應(yīng)T細(xì)胞中分泌IFN-γ的半相合效應(yīng)細(xì)胞。
　　4.CCK-8法檢測(cè)

4、三組效應(yīng)性T細(xì)胞體外殺傷實(shí)驗(yàn):將（A組）CB6F1來源DC和（B組）C57BL/6來源DC及（C組）二者混合的DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL（作為效應(yīng)細(xì)胞，E）分別與小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞(作為靶細(xì)胞，T)按E∶T=50∶1、20∶1和10∶1的比例混合后孵育24 h，加入CCK-8試劑(20μL/孔)，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)的A值，并計(jì)算效應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率。
　　5.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及治療:將荷瘤小鼠C57BL/6完全隨機(jī)

5、分至3組，每組40只。（A組）荷瘤對(duì)照組:每只荷瘤小鼠鼠尾靜脈注射0.2ml生理鹽水;（B組）環(huán)磷酰胺治療組:每只荷瘤小鼠腹腔注入(100mg/kg)環(huán)磷酰胺;（C組）磁珠分選純化半相合CTL治療組:每只荷瘤小鼠鼠尾靜脈注射0.2ml（1×106個(gè)/0.2ml）磁珠分選富集的IFN-γ陽性CB6F1來源效應(yīng)性T細(xì)胞。觀察治療后各組荷瘤鼠腫瘤體積變化及生存期。
　　6.分別在細(xì)胞治療后的第1、4、7、10、14天取小鼠的血清，采用E

6、LISA法檢測(cè)觀察治療后血清中IL-2、IFN-γ含量及其變化，并比較不同治療方法對(duì)荷瘤鼠外周血中兩細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響。
　　7.磁珠分選純化效應(yīng)細(xì)胞治療后第14天，HE染色觀察各組小鼠瘤組織以及肝、脾和小腸組織的形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果:
　　1.C57BL/6小鼠經(jīng)皮下接種5×106 B16黑色素瘤細(xì)胞株7天后可見小鼠皮下明顯的黑色結(jié)節(jié)，直徑達(dá)0.5cm。
　　2.小鼠骨髓來源DC細(xì)胞培養(yǎng)至第6天，倒置相差顯微

7、鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大量具有典型毛刺狀形態(tài)的成熟DC細(xì)胞懸浮在上清液中聚集成團(tuán)，提示DC已經(jīng)發(fā)育成熟，具備提呈抗原能力。
　　3.CCK-8法檢測(cè)不同來源DC提呈腫瘤抗原激活產(chǎn)生的效應(yīng)性T細(xì)胞體外殺傷效率:
　　效靶比為50∶1及20∶1條件下A組（CB6F1來源DC）誘導(dǎo)的效應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)B16細(xì)胞殺傷率優(yōu)于B組（C57BL/6來源DC）及C組(混合DC)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，B組及C組的殺傷率之間無顯著差別（P＞

8、0.05）;效靶比10∶1條件下A、B、C三組效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)B16細(xì)胞殺傷率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　4.各組荷瘤小鼠腫瘤體積變化:
　　單純注射PBS的對(duì)照組和環(huán)磷酰胺組小鼠腫瘤生長(zhǎng)迅速，給予磁珠分選純化的半相合基因型DC-CTL過繼治療后，小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度從第7天至第20天較對(duì)照組顯著下降。
　　5.各組小鼠生存期:
　　A組（荷瘤對(duì)照組），B組（環(huán)磷化療組），C組（細(xì)胞治療組）間生存期比較，

9、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　6.ELISA法檢測(cè)治療后不同時(shí)間小鼠外周血中IL-2和IFN-γ的濃度:
　　在磁珠分選效應(yīng)細(xì)胞治療組中血清IL-2及IFN-γ的含量明顯高于荷瘤對(duì)照組(P＜0.05)。荷瘤小鼠給予磁珠分選效應(yīng)細(xì)胞治療后，血清IL-2和IFN-γ含量伴隨著時(shí)間的變化，出現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，三組外周血中IL-2的濃度均存在顯著性差異（P＜0.05）。
　　7.HE染色結(jié)果:各組荷瘤小鼠瘤組織內(nèi)壞死

10、面積，磁珠分選細(xì)胞治療組和環(huán)磷化療組明顯大于對(duì)照組;觀察磁珠分選細(xì)胞治療后小鼠肝、小腸、脾臟組織中未見明顯組織損傷形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)論:
　　1.在體外實(shí)驗(yàn)中，分別來源于CB6F1及C57BL/6的DC及兩種混合DC誘導(dǎo)的半相合基因效應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞均能產(chǎn)生殺傷效應(yīng)，且CB6F1來源的DC誘導(dǎo)的半相合基因效應(yīng)性T細(xì)胞的殺傷率明顯高于其他兩種誘導(dǎo)方式，另外兩種誘導(dǎo)方式之間的殺傷率未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　

11、2.與環(huán)磷化療組及荷瘤對(duì)照組比較，磁珠分選半相合基因型效應(yīng)細(xì)胞治療組7至21天小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度顯著下降。說明磁珠分選的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，然而，環(huán)磷化療組與荷瘤對(duì)照組相比，其腫瘤生長(zhǎng)抑制作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.磁珠分選半相合基因效應(yīng)性T細(xì)胞過繼免疫治療與環(huán)磷酰胺化療都能夠有效延長(zhǎng)荷瘤C57BL/6小鼠的生存期，但磁珠分選細(xì)胞治療組的生存期明顯優(yōu)于環(huán)磷化療組。
　　4.磁珠分選半相合基因效應(yīng)性T細(xì)胞過繼