雌激素經(jīng)PI3K-AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控E-cadherin、a-actinin-4促進(jìn)shRNA ERa-βSKOV3干擾株轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、卵巢癌是女性生殖器三大惡性腫瘤之一，死亡率最高、療效最不滿意、預(yù)后最差，嚴(yán)重威脅婦女健康。在卵巢原發(fā)性惡性腫瘤中，60-90％是上皮性癌，隨著腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的廣泛開展，鉑類、紫杉醇類及新化療藥物的不斷出現(xiàn)，以及化療方案的不斷改進(jìn)，卵巢癌的治療效果大為改觀，病人的生存質(zhì)量明顯改善，但5年生存率仍徘徊在30％～50％左右。卵巢是雌激素的分泌器官，又是雌激素的靶器官，雌激素對(duì)卵巢腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移影響已受到多方關(guān)注。目前的一些研究發(fā)現(xiàn)，雌激素對(duì)

2、卵巢上皮性腫瘤的轉(zhuǎn)移具有一定促進(jìn)作用，而該作用很可能是雌激素通過(guò)除特異性受體以外的途徑調(diào)控一系列腫瘤基因來(lái)達(dá)到。本課題組前期研究結(jié)果表明雌激素可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并且可通過(guò)非經(jīng)典途徑PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)。
　　此次研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，擬了解在雌激素受體被敲除后，雌激素是否可不通過(guò)特異性受體介導(dǎo)的經(jīng)典途徑，激活非經(jīng)典途徑PI3K/AKT通路影響卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　課題共分兩大部分:1.體外試驗(yàn):采用

3、分子生物學(xué)技術(shù)，了解在雌激素受體被敲低后，雌激素經(jīng)PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)shRNA ERa/β SKOV3干擾株轉(zhuǎn)移侵襲的影響及對(duì)E-cadherin、a-actinin-4蛋白的調(diào)控作用;2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):了解雌激素及AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制劑對(duì)shRNA ERa/β SKOV3干擾株移植瘤播散轉(zhuǎn)移的影響。為臨床理解雌激素對(duì)卵巢癌影響的作用機(jī)制提供理論依據(jù)，探討AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制劑應(yīng)用的效果，為卵巢癌的防治新策略提供科學(xué)依據(jù)。<

4、br>　?、?體外研究:雌激素通過(guò)激活PI3K/AKT非經(jīng)典途徑調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移因子E-cadherin、a-actinin-4蛋白的表達(dá)促進(jìn)shRNAERa/β SKOV3干擾株細(xì)胞的轉(zhuǎn)移
　　目的:研究雌激素通過(guò)PI3K/AKT非經(jīng)典途徑對(duì)shRNA ERa/β SKOV3干擾株轉(zhuǎn)移的影響及對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移因子E-cadherin、a-actinin-4蛋白表達(dá)的調(diào)控。
　　方法:采用慢病毒質(zhì)粒干擾的方法構(gòu)建shRNA ERa/β

5、 SKOV3干擾株;使用蛋白印跡法檢測(cè)雌激素作用后pAKT、AKT蛋白表達(dá)的改變;使用Transwell試驗(yàn)評(píng)價(jià)雌激素及LY294002對(duì)shRNA ERa/β SKOV3干擾株轉(zhuǎn)移能力的影響;使用蛋白印跡法、共聚焦實(shí)驗(yàn)檢測(cè)雌激素及LY294002作用后pAKT、AKT、E-cadherin、a-actinin-4蛋白表達(dá)的改變。
　　結(jié)果:經(jīng)Western blot結(jié)果提示17-β雌二醇能增加pAKT蛋白表達(dá)，并存在時(shí)間和濃度依

6、賴性，但不改變AKT蛋白表達(dá);Transwell試驗(yàn)結(jié)果證明當(dāng)shRNAERa/β SKOV3干擾株細(xì)胞在transwell小室培養(yǎng)48h后，雌激素組穿過(guò)transwell小室的shRNA ERa/β SKOV3干擾株細(xì)胞數(shù)量較control組多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。當(dāng)PI3K/AKT途徑被抑制時(shí)，雌激素促進(jìn)轉(zhuǎn)移的作用被減弱:Transwell試驗(yàn)結(jié)果證明當(dāng)shRNA ERa/β SKOV3干擾株細(xì)胞在transwell

7、小室培養(yǎng)48h后，E+LY294002組穿過(guò)transwell小室的shRNA ERa/β SKOV3干擾株細(xì)胞數(shù)量較雌激素組少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，較LY組多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Western blot結(jié)果提示:17-β雌二醇作用后，較control組E-cadherin表達(dá)下降，胞漿中a-actinin-4表達(dá)增加;雌激素+LY294002聯(lián)合作用后，較單用LY294002組pAKT表達(dá)程度高，E-

8、cadherin表達(dá)下降，胞漿中a-actinin-4表達(dá)增加;胞核中的a-actinin-4表達(dá)在LY294002組最為明顯;經(jīng)共聚焦結(jié)果提示LY294002組E-cadherin漿膜表達(dá)最明顯，a-actinin-4漿膜表達(dá)最不明顯;當(dāng)E+LY294002聯(lián)合作用時(shí)，較LY294002組E-cadherin漿膜表達(dá)明顯下降、a-actinin-4漿膜表達(dá)明顯增加。
　　結(jié)論:在雌激素受體被敲低后，17-β雌二醇能激活PI3K/

9、AKT非經(jīng)典途徑，并且通過(guò)該途徑進(jìn)一步調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移因子E-cadherin、a-aetinin-4蛋白的表達(dá)從而影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
　?、?動(dòng)物實(shí)驗(yàn):雌激素及LY294002對(duì)shRNA ERa/βSKOV3干擾株移植瘤播散轉(zhuǎn)移的影響
　　目的:研究雌激素及LY294002對(duì)shRNA ERa/β SKOV3干擾株移植瘤播散轉(zhuǎn)移的影響。
　　方法:shRNA ERa/β SKOV3干擾株細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代后調(diào)整濃度為5×

10、107個(gè)/ml取0.2ml注射于20只裸鼠腹腔，隨機(jī)分為4組，每組5只。2周后處理如下:
　　(1)空白組:腹腔注射PBS+DMS00.2ml/2天(DMSO占25％)+肌肉注射食用油0.1ml/4天;
　　(2)雌激素組:肌肉注射2μg苯甲酸雌二醇（食用油稀釋至0.1ml）/4天;
　　(3) LY294002組:腹腔注射1mg LY294002(用PBS+DMSO稀釋至0.2ml，DMSO占25％)/2天;

11、　　(4)雌激素+LY294002組:腹腔注射1mg LY294002（用PBS+DMSO稀釋至0.2ml，DMSO占25％）/2天，肌肉注射2μg苯甲酸雌二醇(食用油稀釋至0.1ml)/4天。
　　用藥期間觀察各組裸鼠腹圍變化、記錄體重變化，一個(gè)月后將各組裸鼠處死，觀察各組裸鼠腹腔移植瘤播散情況、比較各組裸鼠移植瘤重量、移植瘤組織pAKT、AKT、E-cadherin、a-actinin-4表達(dá)情況。
　　結(jié)果:各組裸鼠在

12、注射藥物后，出現(xiàn)不同程度行動(dòng)遲緩、反應(yīng)遲鈍，但對(duì)外界的刺激有較好的反應(yīng)。各組裸鼠體重變化無(wú)明顯差異(P＞0.05)。雌激素組裸鼠腹部膨隆最明顯，移植瘤體積最大、個(gè)數(shù)最多、播散最為廣泛，腹壁、腸曲間、肝臟、脾臟均有移植瘤生長(zhǎng)，其中有一只裸鼠的移植瘤擴(kuò)散到胸腔;LY294002組裸鼠的移植瘤體積最小、個(gè)數(shù)最少、播散最為局限，主要以腸曲間及肝臟為主。雌激素組移植瘤重量較control組大，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05); LY294002組移

13、植瘤重量較control組及雌激素組均小，且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);雌激素+LY294002組移植瘤重量較LY294002組大，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。免疫組織法檢測(cè)各組裸鼠腹腔移植瘤組織中pAKT、AKT、E-cadherin、a-actinin-4的表達(dá)，結(jié)果提示:LY294002組、E2+LY294002組移植瘤pAKT的表達(dá)明顯低于E2組（P＜0.05);control組、LY294002組、E2+LY29400

14、2組移植瘤E-cadherin的表達(dá)較E2組高（P＜0.05）;a-actinin-4在E2組以胞漿表達(dá)為主，在LY294002組以胞核表達(dá)為主;AKT在各組移植瘤的表達(dá)無(wú)明顯變化(P＞0.05)。
　　結(jié)論:雌激素能促進(jìn)裸鼠SKOV3干擾細(xì)胞株腹腔移植瘤生長(zhǎng)、播散，LY294002對(duì)其有抑制作用。
　　綜上所述，當(dāng)ERa/β被敲低時(shí)，17-β雌二醇能激活PI3K/AKT非經(jīng)典途徑，并且通過(guò)該途徑進(jìn)一步調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移因子E-c