CHIKV、SINV和JEV可視化基因芯片的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、基孔肯雅病毒(Chikungunya Vrus，CHIKV)和辛德畢斯病毒(Sindbis Virus，SINV)是甲病毒屬單鏈RNA病毒，經(jīng)蚊蟲傳播，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，有致病快，傳播迅速等特點，其流行對世界公共安全造成威脅。目前缺乏對兩種病毒引起疾病的有效治療藥物，因此，對兩種病毒快速有效地進行診斷是預(yù)防控制和減緩病毒傳播的重要措施。
　　乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是RNA

2、病毒，能引發(fā)病毒性的腦炎，經(jīng)庫蚊等在動物與人之間傳播。在亞洲的東部和南部及太平洋等地區(qū)廣泛流行。目前已應(yīng)用乙型腦炎疫苗防治，但尚缺乏特異性抗病毒藥物，因此，對乙型腦炎的早期診斷顯得極為重要。
　　基因芯片技術(shù)(Gene Chip Technology)有較高的特異性和靈敏度及高通量等特點，在對環(huán)境和臨床檢測上有良好的應(yīng)用。目前有多種基因芯片技術(shù)，以熒光、同位素、酶標標記在核酸檢測中比較普遍。但有靈敏度較低，操作復(fù)雜，對條件和設(shè)備有

3、著較高的要求等問題，限制了這類技術(shù)在檢測病例中的應(yīng)用。納米金標記比熒光標記檢測在敏感性上高100倍，簡便快速，不需特殊的儀器，結(jié)果肉眼可看見。本文將納米金標記技術(shù)應(yīng)用在可視化基因芯片制備中，旨在建立對CHIKV、SINV和JEV進行快速、準確、價廉、操作簡單的診斷研究的可視化基因芯片方法，分別探討了CHIKV和SINV熒光檢測基因芯片和可視化檢測基因芯片的制備及兩者的比較與JEV可視化分型基因芯片的制備。主要內(nèi)容包括:
　　一、C

4、HIKV和SINV可視化檢測基因芯片和熒光檢測基因芯片的研制及兩者之間的比較
　　本實驗室已初步建立了CHIKV和SINV熒光檢測基因芯片，在此基礎(chǔ)上，建立了兩種病毒可視化檢測基因芯片和熒光檢測基因芯片。我們以已有CHIKV和SINV E基因序列為模板，重新設(shè)計檢測探針和引物并對探針進行氨基修飾，對引物進行熒光素/生物素修飾。使用芯片點樣儀對探針進行點樣，在37℃的濕潤環(huán)境下將檢測探針固定到醛基玻片上，同時，以分別含CHIKV和S

5、INV E基因的質(zhì)粒為模板擴增待檢測片段，變性后雜交到探針芯片，洗脫后熒光標記基因芯片通過特殊掃描儀掃描分析結(jié)果，而可視化基因芯片利用生物素與鏈霉親和素高度親和的特性在檢測芯片上標記納米金，銀增強實現(xiàn)可視化。以酶切鑒定正確的CHIKV和SINV E基因序列為模板反向轉(zhuǎn)錄為RNA模擬真實的CHIKV和SINV RNA，將CHIKV和SINV RNA分別與提取的PRRSV，JEV-Ⅲ，AIV RNA混合逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，PCR電泳鑒定各病

6、毒cDNA的存在，使用CHIKV和SINV特異引物對各種病毒PCR擴增靶序列并與探針芯片雜交進行可視化基因芯片特異性實驗，同時也進行靈敏度、重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示，可視化基因芯片比熒光檢測芯片方法對CHIKV和SINV的靈敏度檢測結(jié)果分別為2.4×10-6 ng/mL，2.0×10-8 ng/mL和2.4×10-4 ng/mL，2.0×10-5 ng/mL，兩者與PCR方法比較差異顯著，可視化基因芯片比熒光檢測芯片靈敏度可高出100倍，并

7、且可視化基因芯片檢測方法對兩種病毒都具有良好的特異性和重復(fù)性。
　　二、JEV可視化分型基因芯片的研制
　　本實驗室已初步建立了JEV熒光分型基因芯片，以此為基礎(chǔ)建立了JEV可視化分型基因芯片。將已設(shè)計的氨基修飾檢測探針點樣并固定到醛基玻片上，同時，對已有引物序列5'末端進行生物素修飾，以已有的分別含乙型腦炎病毒Ⅰ型(JEV-Ⅰ)和乙型腦炎病毒Ⅲ型(JEV-Ⅲ)的PrM和E基因序列的質(zhì)粒為模板擴增待檢測目的片段，變性后雜交到