鋸緣青蟹性別分化和性腺發(fā)育的EST及基因芯片初步分析.pdf

1、本研究采用SMART技術(shù)結(jié)合DSN處理，成功地構(gòu)建了線性化cDNA文庫(kù)三個(gè)，其中精巢和卵巢文庫(kù)各一個(gè)，另一個(gè)為精巢、卵巢、眼柄、輸精管、射精管和產(chǎn)雄腺混合的文庫(kù)。經(jīng)測(cè)定三個(gè)文庫(kù)的滴度分別為4.8×105 cfu/mL，3.1×106 cfu/mL，5.3×106 cfu/mL，所有三個(gè)文庫(kù)擴(kuò)增后都含有1011以上重組子。各文庫(kù)的插入cDNA長(zhǎng)度均分布在0.5-3kb，經(jīng)隨機(jī)PCR檢測(cè)，初步確定了三個(gè)文庫(kù)重組率分別為93.7％、95.8％

2、和100％。
　　 隨機(jī)從文庫(kù)中挑取6816個(gè)克隆(其中688個(gè)來(lái)自精巢文庫(kù)，926個(gè)來(lái)自卵巢文庫(kù)，5202個(gè)來(lái)自混合文庫(kù))進(jìn)行EST(Expressed Sequence Taq)測(cè)序，共得到6116條ESTs，其中測(cè)長(zhǎng)大于100bp的有5160條，測(cè)長(zhǎng)短于100bp的有813條，其余為空載。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，5160條ESTs共代表了4136個(gè)基因，其中含有575個(gè)疊連群(Contigs)和3561條單基因(Singlets)，平

3、均冗余率為19.84％，平均讀長(zhǎng)為348bp。經(jīng)生物信息學(xué)分析，998個(gè)為已知基因占總ESTs的24.13[％]，已知基因聚類后被初步歸為22類，其中有在生物學(xué)上與sry、sox、卵黃蛋白原、卵黃蛋白原受體、細(xì)胞周期蛋白、泛素、熱休克蛋白家族、抗氧化酶系統(tǒng)等基因具有相關(guān)性的序列。在測(cè)序及生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合相關(guān)軟件(Redhat Linux 9.0、apache、PHP、MySQL、wwwBLAST)構(gòu)建了本地化的序列查詢數(shù)據(jù)庫(kù)

4、，實(shí)現(xiàn)了EST數(shù)據(jù)的本地比對(duì)查詢管理等功能。
　　 以進(jìn)行EST測(cè)序的6816單克隆為模板，去除冗余的克隆后進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增，純化后用自動(dòng)機(jī)械手點(diǎn)印至氨基化玻璃片基上制成含5664(59×96)個(gè)斑點(diǎn)的cDNA芯片。分別取等量成熟的雌雄個(gè)體的性腺總RNA以隨機(jī)6堿基寡核苷酸作為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成參入了aa-dUTP的單鏈cDNA，隨后分別標(biāo)記上Cy3和Cy5染料制成熒光探針去雜交印制在芯片上的探針，經(jīng)激光共聚掃描儀采集電子圖譜后