三種病毒性出血熱熒光與可視化基因芯片檢測方法的建立.pdf

1、病毒性出血熱(Viral hemorrhagic fevers，VHFs)常由4種科的RNA病毒引起，均以發(fā)熱和出血為主要癥狀。目前，大多數(shù)病毒性出血熱無有效疫苗及治療藥物。
　　克里米亞-剛果出血熱(Crimean-Congo hemorrhagic fever，CCHF)是一種由克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV)引起經(jīng)蜱傳播的病毒性疾病，在非洲，亞

2、洲，歐洲南部，中東的30多個(gè)國家都有感染病例的報(bào)道。裂谷熱(Rift Valley fever，RVF)是由裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus，RVFV)引起一種人畜共患病。該病在非洲、中東及也門地區(qū)流行，危害人身安全和畜牧業(yè)發(fā)展。拉沙熱(Lassa fever，LF)是一種由拉沙病毒(Lassa fever virus，LAV)引起的病毒性出血熱，在西非呈地方性流行。由于該病傳染性強(qiáng)，在其他歐美國家也有輸入性病

3、例報(bào)道。
　　目前，病毒分離、血清學(xué)試驗(yàn)、分子生物學(xué)檢測是VHFs的主要實(shí)驗(yàn)室檢測方法。病毒分離，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，不適宜在疫區(qū)外開展。血清學(xué)檢測方法可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)且需要注意樣本的采集時(shí)間?；蛐酒夹g(shù)因具備高通量、微量性、自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，在病原體檢測上有巨大潛力。然而，對實(shí)驗(yàn)條件及設(shè)備要求較高限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。近年來，以納米金標(biāo)記的基因芯片因具備穩(wěn)定、無污染、廉價(jià)的特點(diǎn)正逐漸取代以熒光素標(biāo)記的基因芯片在DNA檢測中大量被使用。<

4、br>　　本研究的目的是建立CCHFV、RVFV和LAV的熒光基因芯片和可視化基因芯片檢測方法。分別以CCHFV和RVFV的S基因，LAV的部分GPC基因和NP基因，設(shè)計(jì)3對引物與6條寡核苷酸探針，下游引物分別修飾熒光素和生物素。以pMD18T-simple為載體，構(gòu)建含三種病毒保守序列的重組質(zhì)粒pMD-CCHFV、pMD-RVFV、pMD-LAV。以人工合成的保守基因序列為模板體外轉(zhuǎn)錄成病毒RNA作為檢測樣本。使用多重PCR對目的片段

5、進(jìn)行擴(kuò)增及標(biāo)記。通過熒光顯微鏡獲取熒光基因芯片雜交結(jié)果。標(biāo)記生物素的擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片雜交后，加入鏈霉親和素標(biāo)記的納米金，形成生物素-鏈霉親和素-納米金復(fù)合物，再通過銀增強(qiáng)試驗(yàn)對信號進(jìn)行再次放大。最后通過特異性試驗(yàn)、靈敏性試驗(yàn)及重復(fù)性試驗(yàn)對兩種基因芯片進(jìn)行評價(jià)。
　　本研究成功建立了三種出血熱病毒的熒光基因芯片和可視化基因芯片檢測方法，且特異性和重復(fù)性良好。運(yùn)用熒光基因芯片可檢測出2.1×10-4ng/ml的pMD-CCHFV擴(kuò)增

6、產(chǎn)物，2.82×10-2ng/ml的pMD-RVFV擴(kuò)增產(chǎn)物，1.73×10-4ng/ml的pMD-LAV擴(kuò)增產(chǎn)物。運(yùn)用可視化基因芯片檢測出2.1×10-3pg/ml的pMD-CCHFV擴(kuò)增產(chǎn)物，2.82×10-1pg/ml的pMD-RVFV擴(kuò)增產(chǎn)物，1.73×10-2pg/ml的pMD-LAV擴(kuò)增產(chǎn)物。相比熒光基因芯片，可視化基因芯片的靈敏度分別提高了100倍(CCHFV)，100倍(RVFV)，10倍(LAV)。結(jié)果表明，本研究所建