5種出血熱病毒RPA檢測(cè)方法的建立及其假病毒陽(yáng)性參考品的制備.pdf

1、病毒性出血熱(Viral hemorrhagic fevers, VHFs)是一類由RNA病毒引起，并以發(fā)熱和出血為主要臨床表現(xiàn)特征的可危及人類和動(dòng)物生命健康的急性傳染病[1]，該病主要由絲狀病毒科、黃病毒科、沙粒病毒科和布尼亞病毒科等4種不同科的病毒引起。出血熱病死率高，危害嚴(yán)重，并且大部分無(wú)可用疫苗和有效的治療手段，因此，建立出血熱病毒快速、簡(jiǎn)便，尤其是適用于現(xiàn)場(chǎng)的應(yīng)急檢測(cè)方法，對(duì)于及時(shí)篩查可疑患者及早控制病毒的傳播流行具有重要意義

2、。
　　扎伊爾型埃博拉病毒(Zaire ebolavirus, ZEBOV)、蘇丹型埃博拉病毒(Sudan ebolavirus, SEBOV)、拉沙病毒(Lassa virus, LASV)、馬爾堡病毒(Marburg virus, MARV)和黃熱病毒(Yellow fever virus, YFV)等均屬于出血熱相關(guān)病毒，具有很高的傳染性和致死率，并且都曾在國(guó)外引起不同程度的暴發(fā)流行，造成了極大的危害。目前在我國(guó)未曾發(fā)現(xiàn)這些

3、病毒的傳播和流行，但是隨著我國(guó)對(duì)外交流日益頻繁，這些病毒的輸入性風(fēng)險(xiǎn)不斷增大[2]，為防范于未然，我們有必要對(duì)這些病毒進(jìn)行更加深入的研究，并建立該類病毒快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)技術(shù)，以便及早地發(fā)現(xiàn)和鑒別病原體，為有效阻斷病毒的傳播奠定基礎(chǔ)。
　　目前對(duì)于出血熱病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要包括病毒分離鑒定、核酸檢測(cè)[3]、抗原抗體檢測(cè)等。其中，病毒分離鑒定是疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但通常需要較高的實(shí)驗(yàn)室條件和操作技能，而且耗時(shí)較長(zhǎng)，存在著生物安全風(fēng)險(xiǎn)[

4、4]。核酸檢測(cè)技術(shù)主要通過(guò)對(duì)病毒靶基因的特異性擴(kuò)增來(lái)進(jìn)行鑒別診斷，主要包括普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。普通PCR技術(shù)簡(jiǎn)單易行，耗時(shí)短，但敏感性不高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有快速、靈敏和特異性高的特點(diǎn)[5-8]，可以實(shí)時(shí)觀察整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程，并對(duì)初始擴(kuò)增模板進(jìn)行定量分析。以PCR為基礎(chǔ)的核酸檢測(cè)方法雖然簡(jiǎn)單快速，但都需要較為昂貴的儀器設(shè)備并在實(shí)驗(yàn)室中完成檢測(cè)?？乖贵w檢測(cè)目前應(yīng)用較多的主要是ELISA檢測(cè)技術(shù)，雖然該檢測(cè)方法已經(jīng)發(fā)展

5、較為成熟，但與核酸檢測(cè)技術(shù)相比，過(guò)程仍舊較為繁瑣耗時(shí)。由此可見(jiàn)，以上病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法在突發(fā)傳染病的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中存在局限。
　　本研究針對(duì)上述5種出血熱病毒建立一種基于新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)-重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase polymerase amplification, RPA)[9,10]的檢測(cè)方法。該技術(shù)通過(guò)模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的酶反應(yīng)過(guò)程，可以在恒溫37℃-42℃之間對(duì)模板DNA進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增，無(wú)需變性，在20分

6、鐘之內(nèi)即可完成整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程。RPA技術(shù)操作簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。本研究根據(jù)上述5種病毒的基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)并合成多套相應(yīng)的RPA引物和探針，進(jìn)行篩選優(yōu)化，得到具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的RPA引物探針。其次，根據(jù)基因保守片段制備含5種出血熱病毒目的基因的假病毒作為RPA反應(yīng)體系的陽(yáng)性參考品。最后，對(duì)RPA反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，并和Real-time PCR檢測(cè)方法進(jìn)行靈敏度的比較，對(duì)RPA反應(yīng)體系擴(kuò)增性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)。<

7、br>　　將制備的假病毒作為模擬樣本處理，然后提取核酸進(jìn)行RPA擴(kuò)增，同時(shí)取本室保存的黃熱病毒減毒株17D（YF17D）提取病毒核酸，進(jìn)行RPA擴(kuò)增，以驗(yàn)證建立的 RPA擴(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)效果。擴(kuò)增結(jié)果表明，本次建立的 RPA檢測(cè)技術(shù)在37℃-42℃之間對(duì)這5種出血熱病毒的 RNA可以進(jìn)行有效的擴(kuò)增，具有良好的特異性。而擴(kuò)增的靈敏度，黃熱病毒和馬爾堡病毒RPA擴(kuò)增與實(shí)時(shí)熒光 PCR相同，達(dá)到1.5×102 copies/反應(yīng)，扎伊爾型埃博拉