索拉非尼對雷帕霉素誘導(dǎo)的肝細胞癌PI3K-AKT及MAPK信號通路異?；罨霓卓棺饔?pdf

1、原發(fā)性肝細胞肝癌是國內(nèi)常見的惡性腫瘤之一。肝癌肝移植作為一種有效的治療手段已在全球廣泛開展,但是移植術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是限制患者長期存活的主要因素。找尋預(yù)防和治療肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的有效手段將有助于提高肝癌肝移植的療效。
　　近年來,多種分子靶向藥物在臨床腫瘤治療中取得了良好效果。針對肝癌細胞中異常激活的,與其生長、增殖、侵襲以及血管生成等行為密切相關(guān)的信號通路,采用分子靶向藥物的輔助治療為肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療

2、提供了新的可能。雷帕霉素作為一種免疫抑制劑已被有效的用于肝移植術(shù)后的抗排斥治療,而其作為一種mTOR抑制劑,其抗腫瘤活性已被多個研究證實。但雷帕霉素的耐藥問題,仍是限制其臨床抗腫瘤應(yīng)用的一大障礙。尋求其他治療方式與雷帕霉素聯(lián)合,從而使雷帕霉素具有的抗排斥及抗腫瘤的雙重優(yōu)勢有機結(jié)合,將為肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)防提供良好的思路。索拉非尼是一種多激酶抑制劑,在抑制MAPK(Ras/Raf/MEK/ERK)通路的同時,還可抑制多種受體酪

3、氨酸激酶的活性,達到良好的抗腫瘤效應(yīng),其安全性及有效性己被廣泛認可。本研究立足于此,旨在探討肝癌細胞對雷帕霉素耐藥的機制以及聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼對雷帕霉素耐藥的拮抗。在本研究中首先觀察到人肝癌細胞株對雷帕霉素單用存在的耐藥現(xiàn)象;耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生與雷帕霉素應(yīng)用導(dǎo)致的P13K/AKT、MAPK信號通路的反饋激活密切相關(guān);索拉非尼可有效的拮抗雷帕霉素導(dǎo)致的P13K/AKT、MAPK異常激活,增強對肝癌細胞生長的抑制;最后在一種潛在的大鼠原位肝癌肝移

4、植模型中探討雷帕霉素與索拉非尼的協(xié)同抗瘤作用。
　　第一部分，雷帕霉素對人肝癌細胞株生長增殖的影響
　　目的:觀察雷帕霉素對人肝癌細胞株HepG2、HCC-LM3生長增殖的作用。
　　方法:應(yīng)用MTT法檢測雷帕霉素在不同藥物濃度(0-100ng/ml)和不同作用時間(24h、48h、72h)下對HepG2、HCC-LM3肝癌細胞株生長增殖的抑制作用。
　　結(jié)果:雷帕霉素對HepG2及HCC-LM3細胞生長增殖存在

5、抑制作用,且呈一定的時間和劑量依賴性;但雷帕霉素對肝癌細胞的抑制作用并不理想,即使較大劑量(100ng/ml)作用較長的時間(72h)其抑制率也在35％以下(HepG228.4％;HCC-LM334.1％)。
　　結(jié)論:雷帕霉素對肝癌細胞株生長的抑制作用并不理想,提示肝癌細胞對雷帕霉素存在耐藥性。
　　第二部分，雷帕霉素對人肝癌細胞P13K/AKT和MAPK通路的激活
　　目的:探討人肝癌細胞株對雷帕霉素耐藥的機制。<

6、br>　　方法:利用HepG2、HCC-LM3肝癌細胞株,分別予不同藥物濃度的雷帕霉素處理2h或同一藥物濃度(50ng/ml)處理不同的時間后提取蛋白,采用Westernblot方法觀察phospho-AKTser473、phospho-p44/42MAPK(ERK1/2)(Thr202/Tyr204)和PDGFR-β的變化情況;采用P13K抑制劑LY294002預(yù)處理細胞后,觀察雷帕霉素(50ng/ml,2h)作用對phospho-A

7、KTser473、phospho-ERK1/2的影響;采用雷帕霉素(10ng/ml)作用24h后,提取RNA,qRT-PCR方法檢測PDGFR-α、PDGFR-β的表達。
　　結(jié)果:雷帕霉素對HCC-LM3和HepG2細胞總AKT、總ERK表達無明顯影響。雷帕霉素對肝癌細胞AKT的激活是一個快速反應(yīng)并長時間持續(xù)的過程,并呈現(xiàn)明顯的時間和劑量依賴性。較低劑量雷帕霉素作用短時間(10ng/ml,2h)對HCC-LM3和HepG2細胞E

8、RK磷酸化水平的上調(diào)作用不明顯,但當(dāng)藥物濃度提高或作用時間延長,ERK異常激活水平就明顯上升,并呈現(xiàn)一定的劑量和時間相關(guān)性。P13K抑制劑LY294002的應(yīng)用可引起肝癌細胞AKT及ERK活化水平的下調(diào);采用LY294002預(yù)處理細胞后再給予雷帕霉素處理,未觀察到磷酸化AKT水平的升高,但對腫瘤細胞ERK仍存在異常激活效應(yīng),但強度有下降。雷帕霉素在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白翻譯水平均上調(diào)了PDGFR-β在HCC-LM3和HepG2細胞中的表達,以對

9、HepG2細胞PDGFR-β表達的上調(diào)最為明顯。
　　結(jié)論:雷帕霉素呈時間與劑量依賴性異常激活A(yù)KT、ERK;AKT的異常激活呈P13K依賴性,而ERK的激活為P13K部分依賴;PDGFR-β的表達水平上調(diào)可能是雷帕霉素異?；罨疉KT和ERK的重要原因。
　　第三部分，索拉非尼對雷帕霉素激活的P13K/AKT和MAPK信號通路的抑制作用
　　目的:觀察索拉非尼單用以及與雷帕霉素聯(lián)合應(yīng)用對肝癌細胞株生長增殖的抑制作用;探

10、討索拉非尼對雷帕霉素激活的P13K/AKT和MAPK信號通路的抑制作用及其機制。
　　方法:利用HepG2、HCC-LM3肝癌細胞株,應(yīng)用MTT法觀察索拉非尼在不同藥物濃度(0-15μM)和不同作用時間(24h、48h、72h)下對生長增殖的抑制作用;應(yīng)用MTT法,觀察不同濃度的索拉非尼(0、2、5、10μM)與雷帕霉素(10ng/ml)聯(lián)合作用在不同作用時間(24h、48h、72h)下對生長增殖的抑制作用;分別予不同藥物濃度的索

11、拉非尼單獨處理細胞2h或同一藥物濃度(5μM)處理不同的時間后提取蛋白,采用Westernblot方法觀察phospho-AKTser473、phospho-ERK1/2和PDGFR-β的變化情況;雷帕霉素(50ng/ml)與不同濃度的索拉非尼聯(lián)合作用2h,以及雷帕霉素(10ng/ml)與索拉非尼(5μM)聯(lián)合作用不同時間,Westernblot方法觀察phospho-AKTser473、phospho-ERK1/2的變化情況。索拉非尼

12、(5μM)單用,以及索拉非尼(5μM)+雷帕霉素(10ng/ml)作用細胞24h后,提取RNA,qRT-PCR方法檢測PDGFR-β的表達。
　　結(jié)果:MTT實驗結(jié)果顯示,聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼能明顯增強雷帕霉素對HCC-LM3和HepG2生長增殖的抑制,且抑制作用的增強呈明顯時間與劑量依賴性。通過Westemblot和RT-PCR結(jié)果顯示,索拉非尼單用可呈劑量與時間依賴地抑制肝癌細胞ERK的活化,對AKT活化的也存在明顯抑制效應(yīng),但抑

13、制效應(yīng)的劑量或時間依賴性較弱;聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼在低濃度作用短時間(2μM,2h)時就能明顯的抑制雷帕霉素導(dǎo)致的腫瘤細胞AKT、ERK異常的激活,并且其抑制效應(yīng)呈明顯的劑量與時間依賴性。索拉非尼單用可明顯下調(diào)PDGFR-β在腫瘤細胞中的表達;聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼明顯下調(diào)了雷帕霉素導(dǎo)致的PDGFR-β在HCC-LM3和HepG2細胞中的過表達。
　　結(jié)論:聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼后,可明顯增強雷帕霉素對腫瘤細胞生長增殖的抑制作用。單獨應(yīng)用索拉非尼

14、可抑制肝癌細胞AKT及ERK的活化。聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼有效的抑制雷帕霉素導(dǎo)致的AKT及ERK的異常激活,這種抑制作用可能與索拉非尼對肝癌細胞PDGFR-β表達及活化的雙重抑制密切相關(guān)。
　　第四部分，雷帕霉素及索拉非尼對大鼠肝細癌體外和體內(nèi)作用的實驗研究
　　目的:探討雷帕霉素及索拉非尼對大鼠肝癌細胞株Morrishepatoma3924A(MH3924A)的體外作用及對大鼠原位肝癌模型的體內(nèi)作用。
　　方法:應(yīng)用MTT

15、法觀察索拉非尼、雷帕霉素單獨及聯(lián)合應(yīng)用在不同藥物濃度和不同作用時間對MH3924A大鼠肝癌細胞株生長增殖的體外抑制作用;分別予不同藥物濃度的雷帕霉素、索拉非尼、雷帕霉素+索拉非尼處理2h或同一藥物濃度處理不同的時間后提取蛋白,采用Westernblot方法觀察phospho-AKTser473、phospho-ERK1/2的變化情況;采用P13K抑制劑LY294002預(yù)處理細胞后,觀察雷帕霉素(50ng/ml,2h)、索拉非尼(5μM,

16、2h)、雷帕霉素(50ng/ml,2h)+索拉非尼(5μM,2h)應(yīng)用對phospho-AKTser473、phospho-ERK1/2的影響;采用雷帕霉素(10ng/ml),索拉非尼(5μM),以及索拉非尼(5μM)+雷帕霉素(10ng/ml)分別作用細胞24h后,提取RNA,qRT-PCR方法檢測。Pdgfr-α、Pdgfr-β的表達。建立ACI大鼠原位肝癌模型,將大鼠隨機分為雷帕霉素組、索拉非尼組、聯(lián)合用藥組、對照組4組后分別處理

17、;定期采用腹部彩超測量移植瘤體積并繪制腫瘤生長曲線;用藥結(jié)束后,觀察腫瘤生長及侵襲轉(zhuǎn)移情況,HE染色比較各組腫瘤壞死程度,PCNA染色觀察腫瘤細胞增殖情況;提取動物腫瘤蛋白,采用Westernblot方法觀察phospho-AKTser473、phospho-ERK1/2的變化情況。
　　結(jié)果:MTT實驗結(jié)果顯示,雷帕霉素對大鼠肝癌細胞株MH3924A生長增殖的抑制效果不理想;聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼后明顯增強了雷帕霉素對MH3924A生

18、長增殖的抑制作用。通過Westernblot實驗顯示,雷帕霉素呈時間與劑量依賴性地上調(diào)MH3924A細胞AKT及ERK活化水平;采用LY294002預(yù)處理MH3924A細胞后再給予雷帕霉素處理,未觀察到磷酸化AKT水平的升高,但對腫瘤細胞ERK仍存在異常激活效應(yīng),盡管強度有下降。單用索拉非尼對MH3924A細胞ERK的活化明顯抑制,但對AKT抑制強度較弱,且無明顯的劑量或時間依賴性;索拉非尼對雷帕霉素誘導(dǎo)異?；罨腁KT和ERK的抑制作

19、用明顯,且存在時間與劑量依賴性。通過RT-PCR顯示,雷帕霉素上調(diào)了MH3924A細胞Pdgfr-α和Pdgfr-β的表達;索拉非尼單用可明顯下調(diào)Padgfr-β在MH3924A細胞中的表達,但對Pdgfr-α表達的下調(diào)作用不明顯;聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼明顯下調(diào)了雷帕霉素導(dǎo)致的Pdgfr-β和Pdgfr-α在MH3924A細胞中的過表達。在大鼠原位肝癌模型中觀察到,雷帕霉素或索拉非尼單獨應(yīng)用,對腫瘤的生長均有明顯的抑制作用;但雷帕霉素單用對腫

20、瘤肺轉(zhuǎn)移、腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等抑制作用并不明顯。聯(lián)合用藥明顯增強了對腫瘤生長及侵襲轉(zhuǎn)移的抑制;聯(lián)合用藥組腫瘤壞死及腫瘤細胞的增殖抑制程度也顯著強于單獨用藥組;雷帕霉素組腫瘤ERK和AKT的活化水平明顯高于對照組;聯(lián)合應(yīng)用索拉非尼在體內(nèi)也可明顯下調(diào)雷帕霉素導(dǎo)致ERK和AKT的異常激活
　　結(jié)論:雷帕霉素與索拉非尼聯(lián)合應(yīng)用增強了對大鼠肝癌細胞株及原位肝癌模型的抗瘤作用;抗瘤作用的增強與索拉非尼對雷帕霉素導(dǎo)致的AKT和IMAPK活化的抑制密