GnRH拮抗劑對(duì)種植窗期子宮內(nèi)膜影響的蛋白質(zhì)組學(xué)研究及靶蛋白初步功能研究.pdf

1、輔助生殖技術(shù)(ART)治療過程中，抑制和防止過早的促黃體生成激素(LH)峰值出現(xiàn)，是控制性超促排卵治療的關(guān)鍵之一。促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRH激動(dòng)劑）和拮抗劑（GnRH拮抗劑）這兩種GnRH類似物被普遍應(yīng)用于防止LH峰早現(xiàn)。GnRH拮抗劑能快速抑制LH釋放，拮抗劑周期因促性腺激素(Gn)用量更少、Gn刺激時(shí)間更短、以及無初始激發(fā)效應(yīng)和較GnRH激動(dòng)劑周期卵巢過度刺激綜合征(OHSS)風(fēng)險(xiǎn)明顯降低等優(yōu)勢(shì)，越來越被廣泛應(yīng)用。在GnRH

2、激動(dòng)劑和GnRH拮抗劑超促排卵周期沒有發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞的質(zhì)量、受精率或胚胎質(zhì)量的顯著差異;然而，許多研究報(bào)道GnRH拮抗劑超促排卵周期中胚胎存在低種植率和低妊娠率的現(xiàn)象。過去十余年，在世界范圍已經(jīng)有多種方法被用于評(píng)估GnRH拮抗劑對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的影響，如組織學(xué)評(píng)價(jià)、基因組學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。然而GnRH拮抗劑對(duì)胚胎著床的影響仍然存在爭(zhēng)議。由于蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能和蛋白質(zhì)之間相互作用是機(jī)體組織行使生物學(xué)功能的重要因素，因而隨著人類基因組項(xiàng)目的完

3、成，生物醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)已經(jīng)從相對(duì)靜態(tài)的基因組學(xué)的分析轉(zhuǎn)移到高度動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。在尋找候選生物標(biāo)志物的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，iTRAQ（同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量）定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有定量準(zhǔn)確、高通量等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于蛋白質(zhì)表達(dá)變化的研究。本研究利用iTRAQ技術(shù)從蛋白質(zhì)組學(xué)水平評(píng)判GnRH拮抗劑對(duì)種植窗期子宮內(nèi)膜容受性的影響，分析與GnRH拮抗劑相關(guān)的潛在的胚胎植入生物標(biāo)志物，并對(duì)主要的靶蛋白進(jìn)行初步的功能研究，為后續(xù)研究GnRH

4、拮抗劑對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的影響及其機(jī)制提出新的研究方向。
　　研究方法和結(jié)果:
　　1)12名因男方因素行ICSI治療的正常婦女中獲取種植窗期子宮內(nèi)膜組織，其中包括接受rFSH和GnRH拮抗劑進(jìn)行控制性超促排卵（簡(jiǎn)稱GnRH拮抗劑治療組）的4名受試者，GnRH激動(dòng)劑和rFSH長(zhǎng)方案進(jìn)行控制性超促排卵（簡(jiǎn)稱 GnRH激動(dòng)劑治療組）的4名受試者，以及4名自然周期的受試者。各組受試者的基本信息沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。
　　2)子宮內(nèi)

5、膜胞飲突掃描電子顯微鏡觀察顯示在此研究中所采集的子宮內(nèi)膜標(biāo)本均處于種植窗期。
　　3)通過iTRAQ定量技術(shù)分析各組子宮內(nèi)膜組織，共鑒定到1938種蛋白質(zhì)。通過定量比較各組的蛋白表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)在自然周期和GnRH激動(dòng)劑治療組間存在24個(gè)蛋白表達(dá)差異，在自然周期和GnRH拮抗劑治療組之間具有39個(gè)蛋白表達(dá)差異（超過1.5倍的差異，p＜0.05）。同時(shí)在自然周期和GnRH拮抗劑治療組以及GnRH拮抗劑和GnRH激動(dòng)劑治療組之間具有差異

6、表達(dá)而在自然周期和GnRH激動(dòng)劑治療組之間沒有差異的有7個(gè)蛋白。選取其中4個(gè)在GnRH拮抗劑組表達(dá)下調(diào)的蛋白ANPEP、 ACO2、CDC5L和GNAS進(jìn)行了Western blot驗(yàn)證。
　　4)通過聚類分析我們發(fā)現(xiàn)自然周期及GnRH拮抗劑治療組的蛋白質(zhì)表達(dá)譜為不同的表達(dá)模式，而自然周期和GnRH激動(dòng)劑治療組之間具有相似的表達(dá)模式。
　　5)通過生物信息學(xué)研究我們發(fā)現(xiàn)在此研究中僅在GnRH拮抗劑治療組差異表達(dá)的蛋白質(zhì)能在多

7、個(gè)細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮作用，包括血管生成，細(xì)胞增殖、凋亡，細(xì)胞遷移，和免疫反應(yīng)，這些都與子宮內(nèi)膜的重要功能相關(guān)。并提示GnRH拮抗劑可能通過抑制EGF的功能，進(jìn)而抑制蛋白GNAS和ANPEP，最終影響子宮內(nèi)膜的功能。推測(cè)此為GnRH拮抗劑作用于子宮內(nèi)膜的與胚胎種植相關(guān)的信號(hào)通路之一。
　　6)通過免疫組化分析我們分析了GnRH拮抗劑調(diào)節(jié)的子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)候選蛋白（如CDC5L，ANPEP，GNAS和Aconitase）的免疫表達(dá)

8、，發(fā)現(xiàn)CDC5L，GNAS和Aconitase均表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞中，而ANPEP主要定位于間質(zhì)細(xì)胞中。與GnRH激動(dòng)劑治療組和自然周期組相比，上述四個(gè)蛋白在GnRH拮抗劑治療組表達(dá)均較弱。這為后續(xù)研究GnRH拮抗劑對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的影響及其機(jī)制提出新的研究方向。
　　結(jié)論:
　　1)通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究，我們發(fā)現(xiàn)自然周期與GnRH拮抗劑刺激周期的子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)表達(dá)譜為不同的表達(dá)模式，而自然周期和GnRH激動(dòng)劑刺激周期之間

9、具有相似的表達(dá)模式。這從理論上為解釋臨床上GnRH拮抗劑超促排卵周期中相對(duì)低種植率和低妊娠率提供了科學(xué)依據(jù)。
　　2)本研究中我們發(fā)現(xiàn)了7個(gè)GnRH拮抗劑調(diào)控的差異蛋白。生物信息學(xué)分析表明這些蛋白參與了與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)的多種生物學(xué)事件，并提示了GnRH拮抗劑作用于子宮內(nèi)膜與胚胎種植相關(guān)可能的信號(hào)通路。這些GnRH拮抗劑調(diào)控的差異蛋白可能是植入相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物。
　　3)我們對(duì)GnRH拮抗劑調(diào)節(jié)的子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)候選