人子宮內(nèi)膜癌比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究及癌相關(guān)蛋白Cyclophilin A的表達(dá)與功能驗(yàn)證.pdf

1、目的：蛋白質(zhì)組學(xué)方法可高通量、整體性的反映組織或細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平的變化，已成為目前研究癌癥發(fā)病機(jī)制、篩選腫瘤標(biāo)記物、尋找藥物作用和基因干預(yù)靶點(diǎn)等的有力手段。本研究擬采用雙向電泳分離子宮內(nèi)膜癌與正常子宮內(nèi)膜組織的總蛋白質(zhì)，建立雙向電泳圖譜，尋找表達(dá)差異點(diǎn)，通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定出癌相關(guān)蛋白候選分子。應(yīng)用RT-PCR、westem Blot和免疫組化等方法在mRNA和蛋白質(zhì)水平對(duì)其表達(dá)差異進(jìn)行驗(yàn)證，并分析與子宮內(nèi)膜癌組織學(xué)分級(jí)、手術(shù)．病理分期等的

2、關(guān)聯(lián)性。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)對(duì)該基因在細(xì)胞增殖、凋亡等方面的生物學(xué)功能進(jìn)行初步的探討。以期通過(guò)此研究，為進(jìn)一步揭示子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制，尋找有意義的腫瘤標(biāo)記物及基因干預(yù)的靶點(diǎn)，提供新的線(xiàn)索和思路。 方法：取8例子宮內(nèi)膜樣腺癌和8例增生期正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本，配對(duì)分為8組。提取組織總蛋白，通過(guò)雙向電泳技術(shù)分離總蛋白，并得到8組雙向電泳凝膠圖譜。通過(guò)PDQuest7.1.1軟件對(duì)圖像進(jìn)行裁剪、斑點(diǎn)檢測(cè)和匹配分析，評(píng)價(jià)圖像的匹配率，并檢測(cè)

3、出表達(dá)差異點(diǎn)。將差異點(diǎn)切下后進(jìn)行膠上原位酶解，然后通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-Q-TOF MS/MS)及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。在鑒定出的差異點(diǎn)中選擇表達(dá)恒定，差異明顯且穩(wěn)定，質(zhì)譜結(jié)果理想可靠的蛋白作為子宮內(nèi)膜癌相關(guān)蛋白候選分子。采用RT-PCR和Western Blot方法對(duì)候選分子在子宮內(nèi)膜癌與正常子宮內(nèi)膜組織間的表達(dá)差異在mRNA和蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)該蛋白在52例子宮內(nèi)膜樣腺

4、癌和39例增生期正常子宮內(nèi)膜、16例宮頸癌和10例正常宮頸上皮組織石蠟標(biāo)本中的表達(dá)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量打分和Imagepro.Plus5.0軟件測(cè)定IOD值，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)其在癌與正常組織間的表達(dá)差異性和與組織學(xué)分級(jí)、手術(shù)-病理分期的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，將針對(duì)靶基因的siRNA以脂質(zhì)體Lipofectamine2000為載體轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞，抑制靶基因RNA表達(dá)水平，通過(guò)MTT、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞克隆形成

5、實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡，細(xì)胞周期等情況，對(duì)該基因的生物學(xué)功能進(jìn)行初步的探討。 結(jié)果：得到8組分辨率高，重復(fù)性好的人子宮內(nèi)膜癌與正常子宮內(nèi)膜的雙向電泳圖譜，檢測(cè)的平均斑點(diǎn)數(shù)分別為782±28和760±33，各組內(nèi)兩張膠的匹配率(％)平均為85.625±4.2。共篩選出112個(gè)差異點(diǎn)，其中60個(gè)在癌組織中上調(diào)，52個(gè)下調(diào)。經(jīng)質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索成功鑒定出99個(gè)蛋白，質(zhì)譜分析成功率達(dá)88.4％，其中21個(gè)蛋白質(zhì)譜結(jié)果理想，膠上差

6、異明顯，重復(fù)次數(shù)在4次以上。對(duì)鑒定出的差異蛋白進(jìn)行了功能和細(xì)胞定位的分析和歸類(lèi)，并確定cyclophilin A為子宮內(nèi)膜癌相關(guān)蛋白候選分子。RT-PCR結(jié)果顯示癌組織中cyclophilinA基因與其受體CD147基因表達(dá)分別為正常組織的2.49倍(P<0.01)和3.69倍(P<0.01)。Western Blot結(jié)果顯示癌組織中cyclophilinA蛋白表達(dá)為正常組織的2.55倍(P<0.01)，具有顯著性差異，與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果

7、一致。免疫組化結(jié)果顯示該蛋白主要表達(dá)于胞漿及部分胞核。半定量積分法及圖像分析法顯示子宮內(nèi)膜癌組織表達(dá)顯著高于正常組織(P<0.01)；并且表達(dá)與組織病理學(xué)分級(jí)具有關(guān)聯(lián)性，隨組織分化程度降低，表達(dá)升高(P<0.01)；與手術(shù).病理分期無(wú)關(guān)聯(lián)性(P>0.05)。宮頸癌組織表達(dá)高于正常宮頸組織，同樣具有顯著性差異(P<0.01)。cyclophilin A-siRNA轉(zhuǎn)染HEC-1-B細(xì)胞可顯著抑制靶基因表達(dá)，抑制率達(dá)60％以上。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增

8、殖活性顯著下降，并隨濃度增加和時(shí)間延長(zhǎng)而增加。100nM抑制效應(yīng)最強(qiáng)，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)抑制率可達(dá)52.4％(P<0.01)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)顯示培養(yǎng)14天后轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆形成數(shù)目、克隆形成率等顯著低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P<0.01)。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率顯著增加，72小時(shí)凋亡率(％)達(dá)45.7±3.1(P<0.01)，并伴有G<,0>/G<,1>期比例升高，S期比例下降等細(xì)胞周期變化。 結(jié)論：本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)得到了子宮內(nèi)膜癌與正常子宮內(nèi)膜

9、組織的蛋白表達(dá)圖譜，篩選出112個(gè)表達(dá)差異點(diǎn)，并鑒定出其中99個(gè)蛋白，確定cyclophilin A為子宮內(nèi)膜癌相關(guān)蛋白候選分子。通過(guò)RT-PCR、Western Blot和免疫組化等方法驗(yàn)證了該蛋白在癌與正常組織的表達(dá)具有顯著性差異，并認(rèn)為與組織病理學(xué)分級(jí)具有關(guān)聯(lián)性，與手術(shù)-病理分期無(wú)關(guān)聯(lián)性；對(duì)宮頸癌組織的檢測(cè)也得到類(lèi)似結(jié)果。通過(guò)RNA干擾抑制cyclophilin A基因的表達(dá)，顯示該蛋白具有與促進(jìn)增殖，抑制凋亡相關(guān)的生物學(xué)功能。本