DNMT1RNA1重組桿狀病毒載體對(duì)胰腺癌細(xì)胞PaTu8988的影響.pdf

1、胰腺癌是一種惡性程度極高的消化道惡性腫瘤。近年來(lái),其發(fā)病率在世界各地均有迅速增加,在男性居惡性仲瘤死亡因?yàn)榈牡谖逦?在女性居惡性腫瘤死亡因?yàn)榈牡谒奈?5年生存率僅為1％-4％[1-4]。胰腺癌早期一股沒(méi)有明顯癥狀,出現(xiàn)臨床癥狀就診時(shí)往往已發(fā)生轉(zhuǎn)移,喪失手術(shù)時(shí)機(jī),且由于其轉(zhuǎn)移傾向以及對(duì)細(xì)胞毒性化療藥物產(chǎn)生耐受性,而導(dǎo)致傳統(tǒng)非手術(shù)療法通常無(wú)效,預(yù)后極差。目前臨床上對(duì)晚期胰腺癌缺少有效的治療方法。因此,迫切需要進(jìn)一步深入探討其發(fā)生、發(fā)展的分子

2、機(jī)制,從而尋找更有效的早期診斷與治療措施,改善其預(yù)后。
　　 DNA甲基化是重要的基因表觀修飾方式之一[5]。DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性,去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)[6]。DNA的甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’甲基胞嘧啶[7]。這種DNA修飾方式并沒(méi)有改變基因序列,但是它調(diào)控了基因的表達(dá)。近年,研究表明在多種人類

3、腫瘤基因組中,廣泛低甲基化和部分區(qū)域的高甲基化共存是DNA甲基化水平總的特征,5’端CpG島局部高甲基化致抑癌基因失活是引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要步驟[8]。
　　 DNMTs家族中主要有DNMT1,DNMT2,DNMT3a,DNMT3b四種酶[9]。DNMT1是在體細(xì)胞中最豐富的甲基轉(zhuǎn)移酶,被認(rèn)為是主要的具有維持甲基化作用的酶。目前認(rèn)為甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)水平反映了腫瘤中增殖細(xì)胞的生理狀態(tài)和各種分化缺陷。研究發(fā)現(xiàn),甲基轉(zhuǎn)移酶活性增加是

4、所有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征之一,甲基轉(zhuǎn)移酶活性增加能誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,這可能是CpG島甲基化程度的提高使抑癌基因表達(dá)受抑制或影響了細(xì)胞周期。
　　 多項(xiàng)研究證明基因異常甲基化在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起作用,其中,DNMTs在基因的異常甲基化中起了非常重要的作用[10]。另外,靶向性的沉默DNMT1可以引起腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制、凋亡增加伴有DNA甲基化改變。Peng等研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)胰腺癌相關(guān)基因甲基化與DNMT1蛋白表達(dá)相關(guān),同時(shí)發(fā)現(xiàn)在胰腺導(dǎo)

5、管上皮內(nèi)瘤變向進(jìn)展期胰腺癌的發(fā)展過(guò)程中,DNMT1起了非常重要的作用[11]。Rhee等發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株中靶向性沉默DNMT1基因,只能引起細(xì)胞總體甲基化水平下降20％,并不能有效引起抑癌基因啟動(dòng)子的去甲基化和抑癌基因的重新表達(dá)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)同時(shí)剔除DNMT1和DNMT3b基因,可以引起細(xì)胞總體甲基化水平下降95％,引起許多抑癌基因的重新表達(dá),并有效抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]。Oridate等利用siRNA干擾人肺非

6、小細(xì)胞癌A549細(xì)胞株后,使DNMT1蛋白表達(dá)明顯降低,對(duì)細(xì)胞生存有明顯抑制作用,使生存率下降至原先的75％和65％,且抑制作用明顯高于甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(5-aza-dC)；同時(shí)抑癌基因p21的表達(dá)明顯升高[13]。Suzuki等研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)沉默DNMT1基因可以使非小細(xì)胞肺癌NCI-H1299和乳腺癌HCC1954細(xì)胞的RASSF1A,p16ink4A,CDH1和HPP1基因啟動(dòng)子的甲基化水平降低80％,同時(shí)伴有這些抑癌基因重新表達(dá)[

7、14]。Robert等研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論使用反義核苷酸還是siRNA,選擇性敲除DNMT1,均能明顯降低結(jié)腸癌王HCT116、SW48和SW480細(xì)胞內(nèi)的DNMT的活性,并引起細(xì)胞總體甲基化水平下降和抑癌基因CDKN2A的重新表達(dá)。Leu等研究發(fā)現(xiàn)在抑制卵巢癌CP70細(xì)胞生長(zhǎng)方面,聯(lián)合沉默DNMT3b和DNMT1基因?qū)σ种颇[瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)沉默DNMT3b基因；去甲基化作用方面,聯(lián)合兩種siRNA干擾引起癌細(xì)胞去甲基化的作用較明顯

8、；單獨(dú)沉默DNMT3b或DNMT1基因,可以引起TWIST、RASSF1A和HIN-1 mRNA表達(dá)升高1-3倍,同時(shí)沉默DNMT1和DNMT3b可引起TWIST、HIN-1mRNAs升高7倍,RASSF1A mRNAs升高15倍。認(rèn)為維持細(xì)胞內(nèi)甲基化的關(guān)鍵酶是DNMT1,DNMT3b只是起輔助DNMT1的作用[15]。Ting等研究發(fā)現(xiàn)沉默DNMT1基因后,結(jié)腸癌SW48細(xì)胞、膀胱癌T24細(xì)胞內(nèi)甲基轉(zhuǎn)移酶的活性明顯下降,但細(xì)胞內(nèi)仍維持

9、了DNA高甲基化水平。但乳腺癌T47D用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染干擾DNMT1 mRNA后,DNMT1蛋白表達(dá)明顯下降,甲基轉(zhuǎn)移酶的活性降低90％,同時(shí)細(xì)胞的Cdkn2a、Sfrp1和Gata4基因的啟動(dòng)子發(fā)生去甲基化,基因的mRNA明顯升高。提示對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)甲基化水平,不同的人腫瘤細(xì)胞對(duì)DNMT1的依賴程度是不同的[16]。Sowińska等構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)沉默DNMT1和(或)DNMT3b基因的乳腺癌MCF-7細(xì)胞和胰腺癌AsPC1細(xì)胞的細(xì)胞株,分

10、別干預(yù)DNMT1和DNMT3b可引起甲基化水平下降59％、57％、45％和38％,聯(lián)合干擾兩個(gè)基因可引起CXCL12啟動(dòng)子CpG島甲基化水平下降75％和68％,同時(shí)發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-dAzaC可引起CXCL-12啟動(dòng)子CpG島甲基化水平下降93％和94％[17]?？偟膩?lái)說(shuō),DNMTs在多種腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展中起了重要的作用,DNMT1和DNMT3b在不同腫瘤疾病中所起的作用不盡相同。目前,DNMTs在胰腺癌中的起所起的作用,以及

11、沉默DNMT1基因?qū)σ认侔┑闹委熥饔萌绾蔚难芯可跎佟?br>　　 本研究主要通過(guò)構(gòu)建攜帶DNMT1 RNAi基因的重組桿狀病毒載體,并以此進(jìn)一步研究DNMT1對(duì)胰腺癌細(xì)胞及相關(guān)基因的影響。通過(guò)構(gòu)建攜帶DNMT1 RNAi基因的重組桿狀病毒載體,沉默DNMT1基因觀察其對(duì)胰腺癌細(xì)胞周期及胰腺癌相關(guān)基因的影響。本研究分二部分:
　　 1、構(gòu)建攜帶DNMT1 RNAi基因的重組桿狀病毒載體。結(jié)果表明重組桿狀病毒能夠感染PaTu898