Cytc對桿狀病毒誘導(dǎo)斜紋夜蛾細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、我們以前的研究結(jié)果已證明，在芹菜夜蛾核型多角體病毒(Syngraphafalciferamultiplenuclearpolyhedrosisvirus，SfaMNPV)誘導(dǎo)斜紋夜蛾(SpodopteralituraCells，SL-1)細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞色素c(Cytochromec，cytc)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，不斷從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。本實(shí)驗(yàn)仍然以SfaMNPV誘導(dǎo)SL-1細(xì)胞的凋亡系統(tǒng)為研究對象，利用環(huán)孢菌素A(Cyclos

2、prinA，CSA)對線粒體膜完整性的保護(hù)作用，進(jìn)一步研究了cytc對此凋亡系統(tǒng)的影響作用。完成的工作包括以下幾個(gè)方面： (1)cytc的釋放與線粒體膜電位的關(guān)系用流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位(△ψm)的變化，并用western檢測線粒體與細(xì)胞質(zhì)中cytc的變化。結(jié)果表明病毒感染4hr后即出現(xiàn)膜電位的下降，且下降趨勢呈時(shí)間依賴性；而病毒加CSA處理后的細(xì)胞其線粒體膜電位下降趨勢并不明顯。Western檢測到病毒感染實(shí)驗(yàn)組，隨感染時(shí)

3、間的延長，線粒體中cytc的量逐漸降低，細(xì)胞質(zhì)中cytc的量逐漸升高；而病毒加CSA處理組，線粒體中cytc的量并沒有隨著感染時(shí)間的延長而明顯降低，即CSA抑制了線粒體膜電位的降低和cytc從線粒體到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位。這表明在SfaMNPV這種凋亡誘導(dǎo)因子的作用下，cytc從線粒體到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位可能依賴于線粒體膜的通透性。 (2)cytc對caspase-3的活性及凋亡形態(tài)的影響對caspase-3的活性檢測，首先用caspase-

4、3特異性序列人工合成熒光底物AC-DEVD-AFC與所提取的細(xì)胞裂解液成份反應(yīng)，置熒光分光光度計(jì)上檢測，結(jié)果顯示SfaMNPV感染4小時(shí)后即檢測到caspase-3的活性，且其活性呈時(shí)間依賴性增強(qiáng)。用caspase-3兔抗多克隆抗體進(jìn)行western檢測，procaspase-3的表達(dá)量逐漸減少，即caspase-3活性逐漸增加。而病毒加CSA處理組的熒光強(qiáng)度值與procaspase-3的表達(dá)量都沒有明顯的變化。表明CSA抑制了casp

5、ase-3的活性。 對細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察，分別對三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞進(jìn)行DAPI染色，DNA電泳，置熒光顯微鏡下與紫外燈下觀察、拍照，其結(jié)果顯示CSA處理后的細(xì)胞經(jīng)DAPI染色未被檢測到凋亡小體，DNA電泳也未檢測到有梯形條帶。筆者的實(shí)驗(yàn)還證明了在處理時(shí)間范圍內(nèi)CSA本身對細(xì)胞并不致死，因此推測CSA保護(hù)了線粒體膜的完整性，抑制cytc從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而抑制caspase-3的活化與DNA片段化的下游事件，這提示了cytc