B細胞惡性腫瘤免疫球蛋白基因重排的相關(guān)研究及臨床意義.pdf

1、一、目的： B細胞惡性腫瘤是一種來源于B細胞系的淋巴細胞腫瘤，在我國主要包括B細胞急性淋巴細胞白血病(B-acutelymphoblasticleukemia，B-ALL)、B細胞惡性淋巴瘤(Bcelllymphoma)及多發(fā)性骨髓瘤(multiplmyeloma，MM)等。近年來大劑量化療的應(yīng)用、新的靶向分子治療的開展、新藥的使用及自體/異體造血干細胞移植的開展，使B細胞惡性腫瘤的治療較前有了很大進展。但相當一部分患者存在復(fù)發(fā)

2、的危險，成為目前治療的難點。目前認為，引起惡性血液病復(fù)發(fā)的主要原因之一為微小殘留病(Minimalresiduadisease，MRD)。對MRD進行檢測不僅可以判斷預(yù)后，更可早期預(yù)測復(fù)發(fā)，根據(jù)MRD的水平進行預(yù)后分級，指導(dǎo)完全緩解(completeremission，CR)后的治療等。B淋巴腫瘤細胞發(fā)育過程中出現(xiàn)的免疫球蛋白(immtmoglobulin，Ig)基因重排序列都具有克隆特異性，被認為是“DNA指紋”，而被作為分子標志用于

3、輔助疾病診斷和MRD的檢測。本實驗將針對B細胞惡性腫瘤的Ig重排基因，進行以下研究： 1、建立PCR檢測B細胞腫瘤患者血漿DNA標本中Ig重鏈(IgH)基因重排的方法，探討血漿DNA標本中IgH基因重排對輔助診斷及判斷預(yù)后的臨床意義。 2、探討B(tài)IOMED-2引物系統(tǒng)檢測成人ALL患者Ig基因重排的敏感性，分析B-ALL患者Ig基因重排方式、各胚系基因的利用頻率。 3、建立以SYBRGreenI染料法的實時定量P

4、CR(Real-timeQuantitativePCR，RQ-PCR)檢測特異性Ig基因重排的方法。 二、方法： 1、收集83例成人B細胞惡性腫瘤患者共110份血漿標本，其中B-ALL患者34例、B-NHL患者36例、刪患者13例。初治和復(fù)發(fā)標本63份、緩解標本47份。同時收集其中35例ALL和MM的骨髓標本作為平行對照。15例發(fā)熱待查、12例系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)及8例類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者的血漿標本為陰性對照，

5、20例健康體檢者血漿標本為正常對照。 2、培養(yǎng)Raji細胞系作為陽性對照細胞系。 3、提取血漿和細胞DNA，采用一對通用保守引物對IgH基因重排進行PCR擴增，分析其與疾病進程、疾病分期、血清β2-微球蛋白(β2-MG)、乳酸脫氫酶(LDH)水平及臨床預(yù)后等因素的關(guān)系。 4、收集29例初治成人ALL的骨髓單個核細胞DNA，其中B-ALL患者24例，T-ALL患者5例。采用BIOMED-2引物系統(tǒng)中針對IgH和Ig

6、輕鏈(IgL)重排基因的引物進行擴增。 5、將PCR產(chǎn)物直接測序，測序結(jié)果使用IgBLAST數(shù)據(jù)庫和IMGT/V-QUEST系統(tǒng)比對分析其重排類型、胚系基因片段利用及體細胞突變情況。 6、根據(jù)測序結(jié)果，在Ig基因的特異性連接區(qū)域設(shè)計等位基因特異性寡核苷酸(AlleleSpecificOligonucleotide，ASO)引物，建立采用SYBRGreenRQ-PCR技術(shù)進行腫瘤細胞定量分析，使用熔解曲線，鑒別擴增產(chǎn)物的特

7、異性。 三、結(jié)果： 1、63例初發(fā)和復(fù)發(fā)的B細胞惡性腫瘤血漿標本IGH陽性率為77.8％，47份緩解病例的陽性率27.6％，初發(fā)和復(fù)發(fā)患者IGH陽性率顯著高于緩解病例(P=0.000)。血漿和骨髓標本檢測結(jié)果有較好的一致性(P=0.625)。結(jié)締組織病、感染性疾病及健康人的血漿循環(huán)DNA的IGH重排PCR檢測呈陰性結(jié)果。 2、在NHL和刪患者中，患者IGH重排陽性結(jié)果與臨床分期無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別等于

8、0.624和0.487)。 3、在NHL和MM患者中，LDH水平在IgH基因重排檢測陰性組和陽性組分別為(220.50±70.22)U/L和(219.48±87.19)U/L，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.963)。β2-MG水平在IgH基因重排陰性組和陽性組分別為(2.47±0.90)mg/L和(2.93±1.71)mg/L，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.230)。 4、對16例患者的追蹤檢測結(jié)果：12例初發(fā)時檢測陽性的患者治

9、療獲CR后轉(zhuǎn)為陰性，其中3例病人在緩解后復(fù)查再次轉(zhuǎn)為陽性，隨后此3例患者均出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)，檢測轉(zhuǎn)陽較臨床復(fù)發(fā)提前(1～4)個月。1例ALL患者在初診和CR期間檢測均為陽性，但經(jīng)異基因造血干細胞移植后轉(zhuǎn)為陰性，此患者目前仍處于CR狀態(tài)。3例檢測始終陽性的患者療效不佳，未獲緩解。 5、BIOMED-2引物系統(tǒng)檢測29例初發(fā)ALL患者的結(jié)果：24例B-ALL患者中IGH完全重排陽性率為70.8％，不完全重排為12.5％，IGKVH-JH

10、重排為29.2％，IGK刪失元件(IGK-Kde)重排為25.0％，未檢測出IGL陽性重排。所有B-ALL患者Ig基因重排檢出率可達100％。5例T-ALL患者1例檢測到IGH不完全重排陽性，2例IGKVH-JH重排陽性，2例未檢測出Ig基因重排。 6、對序列結(jié)果分析：B-ALL中IGH重排優(yōu)先利用的V、D、J家族分別為VH3、DH3和JH6。5例IGK重排中4例利用了VK1家族。重排基因中發(fā)生替代突變(replacement，

11、R)的基因占23.5％。替代突變零星散布于Ig基因全長，互補決定區(qū)中替代突變與靜寂突變(silent，S)的比例<1。 7、建立ASO引物SYBRGreenI實時熒光定量PER檢測IgH基因重排的方法，其敏感性可達0.05ng/μl。利用熔解曲線分析可以區(qū)別出特異性和非特異性擴增。通過監(jiān)測2例ALL患者顯示該方法可用于MRD水平動態(tài)定量檢測。 四、結(jié)論： 1、初治B細胞腫瘤患者血漿游離DNA中檢測IgH基因重排陽

12、性率高、取材簡便，有望用于大部分B細胞腫瘤輔助診斷，追蹤檢測還有助于判斷預(yù)后。 2、BIOMED-2引物系統(tǒng)可以檢測出所有B-ALL患者的Ig基因重排，是一種有效的檢測工具，為定量分析MRD水平奠定了基礎(chǔ)。但該系統(tǒng)過于復(fù)雜，操作繁瑣，成本較高，應(yīng)篩選其中高效、實用的引物對，以節(jié)約成本、提高效率。建議選擇IGHVH-JH重排中的FRl、FR2和IGK-Kde引物管組合擴增。 3、建立ASO引物SYBRGreenI的RQ-P