視神經(jīng)脊髓炎免疫球蛋白G檢測：方法學(xué)比較和臨床意義.pdf

1、研究背景：
　　 視神經(jīng)脊髓炎(Neuromyelitis optica，NMO)與多發(fā)性硬化(multiplesclerosis，MS)在臨床上鑒別困難。臨床、組織病理學(xué)和免疫遺傳學(xué)的研究都提示NMO有著自身的特征，不同于MS。近年來，血清中的一種抗體，稱視神脊髓炎免疫球蛋白G(NMO-IgG)或水通道蛋白-4(Aquaporins-4，AQP-4)抗體，被認(rèn)為是區(qū)分兩者的重要標(biāo)志物。間接免疫熒光試驗(yàn)(indirectimmu

2、nofluorescence assays,IFA)證實(shí)該抗體能結(jié)合小鼠軟腦膜、軟膜下、virchow-Robin腔及小腦、中腦、脊髓的灰白質(zhì)交界微血管的AQP-4。
　　 文獻(xiàn)中已報道了多種檢測血清中NMO-IgG/AQP4抗體方法，包括了經(jīng)典法(Original NMO-IgG assay)、放射免疫沉淀分析法(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)，熒光免疫沉淀分析法(fluorescenc

3、eimmunoprecipitation assay,FIPA)、酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、AQP4抗體分析法(AQP4 antibody assay)、Western blot法、免疫組化法、流式細(xì)胞等方法。但是關(guān)于NMO-IgG/AQP4抗體的檢測及該抗體與NMO的關(guān)系仍然存在一些懸而未決的問題：(1)目前尚未見何種方法作為“金標(biāo)準(zhǔn)”被推薦應(yīng)用于NMO-Ig

4、G/AQP4抗體的檢測；(2)在同批次的血清檢測中，不同檢測方法的檢測結(jié)果往往存在不一致性，尤其是經(jīng)典法檢測的NMO-IgG，其靶抗原是否一定是AQP4目前尚存在疑問：(3)血清中的NMO-IgG/AQP-4抗體是區(qū)分MS與NMO的重要血清標(biāo)志物，但是腦脊液中的該類抗體檢測是否等同于血清中的檢測尚未見深入的分析；(4)中國的脫髓鞘患者有別于西方國家，累及視神經(jīng)和脊髓的患者比率更高，針對這一類患者我們采取何種防治方式的任務(wù)非常艱巨，所以早

5、期診斷與鑒別診斷國人NMO并闡明其發(fā)病機(jī)制意義重大。目前，國外對NMO-IgG/AQP4抗體與NMO的關(guān)系研究比國內(nèi)深入，但是中國的NMO患者的NMO-IgG/AQP4抗體流行病學(xué)情況及其與臨床特征的關(guān)系很少有進(jìn)行系統(tǒng)性的研究。
　　 研究目的：
　　 [1]建立檢測NMO-IgG/AQP4抗體的間接免疫熒光方法和描述其注意事項(xiàng)。
　　 [2]簡化NMO-IgG/AQP4抗體的間接免疫熒光程序，并比較C57小鼠、

6、SD大鼠、猴腦基質(zhì)和轉(zhuǎn)染AQP4基因的HEK-293細(xì)胞基質(zhì)對NMO-IgG/AQP4抗體的間接免疫熒光檢測效果的差別，篩選出NMO-IgG/AQP4抗體較理想的方法。
　　 [3]初步探討了不同方法檢測NMO-IgG/AQP4抗體結(jié)果不一致的可能原因。
　　 [4]探討細(xì)胞法檢測視神經(jīng)脊髓炎患者腦脊液AQP4抗體的價值。
　　 [5]初步分析中國的NMO患者的AQP4抗體與臨床特征的關(guān)系。
　　 研究方

7、法：
　　 [1]免疫組化方法(鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法法和間接免疫熒光法)檢測AQP4蛋白在在C57小鼠、SD大鼠、猴各器官組織和轉(zhuǎn)染AQP4基因的人胚腎細(xì)胞(HEK-293)的分布。
　　 [2]經(jīng)典法檢測NMO-IgG：選擇C57小鼠小腦、中腦、腎臟和胃冰凍切片作為基質(zhì)。人血清經(jīng)稀釋、豚鼠肝粉預(yù)處理后，滴加于封閉液處理的上述切片，4℃過夜后滴加熒光素結(jié)合的羊抗人IgG的抗體，封片、熒光顯微鏡觀察。實(shí)驗(yàn)通過

8、熒光雙標(biāo)技術(shù)確定NMO-IgG結(jié)合部位與AQP4表達(dá)位置是否一致。
　　 [3]比較經(jīng)典法和修改法檢測的差異：選取182血清樣本，經(jīng)典法和修改法分別檢測上述血清的NMO-IgG，McNemar檢驗(yàn)和Kappa檢驗(yàn)評價兩種方法的診斷一致性，卡方檢驗(yàn)比較兩種方法對NMO-IgG陽性率差異和臨床診斷價值。
　　 [4]對比不同基質(zhì)檢測的差異：選擇來自于C57小鼠、SD大鼠、猴腦冰凍切片作為檢測NMO-IgG抗體的基質(zhì)，轉(zhuǎn)染AQ

9、P4基因的HEK-293細(xì)胞作為檢測AQP4抗體的基質(zhì)，猴胃、胰腺、腎冰凍切片和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體的基質(zhì)。來源于NMO、MS等脫髓鞘患者或其它對照患者的血清經(jīng)稀釋處理后，滴加于上述基質(zhì)，4℃孵育后、過夜后滴加熒光素結(jié)合的羊抗人IgG的抗體，封片、熒光顯微鏡觀察。McNemar檢驗(yàn)和Kappa檢驗(yàn)評價不同方法的診斷一致性，卡方檢驗(yàn)評價不同方法對NMO診斷的臨床價值。
　　 [5]腦脊液中AQP4抗體的檢測：納

10、入130例患者腦脊液和血清，細(xì)胞檢測兩類體液的AQP4抗體，統(tǒng)計分析兩種體液中AQP4抗體對NMO的診斷價值。
　　 [6]臨床資料分析，采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件，對比各種參數(shù)，行相關(guān)性分析。
　　 研究結(jié)論：
　　 [1]C57小鼠，SD大鼠和猴的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(軟腦膜、軟膜下、微血管、室管膜和小腦蒲肯野細(xì)胞)、胃、肺和腎組織均是AQP4主要表達(dá)豐富的部位，而轉(zhuǎn)染AQP4基因的人胚腎細(xì)胞(HEK-293)的

11、胞膜和胞質(zhì)表達(dá)AQP4蛋白，提示它們能作為間接免疫熒光底物來檢測血清中靶向該種抗原的抗體。
　　 [2]以C57小鼠的小腦、腎臟和胃冰凍切片作為基質(zhì)，通過間接免疫熒光經(jīng)典法能成功檢測出人血清中的NMO-IgG抗體，有助于我們對視神經(jīng)脊髓炎進(jìn)行診斷與鑒別診斷。
　　 [3]修改小鼠腦間接免疫熒光法對NMO-IgG的檢測靈敏度和NMO總的診斷正確率高于經(jīng)典法。
　　 [4]通過對C57小鼠、SD大鼠、猴腦基質(zhì)和轉(zhuǎn)染A

12、QP4基因的HEK-293細(xì)胞基質(zhì)檢測了NMO、MS、，ON、LETM及對照組血清中的IgG抗體，從臨床診斷指標(biāo)(靈敏度與特異度)比較，細(xì)胞法檢測AQP4抗體具有高靈敏度和高特異性，推薦其應(yīng)用于脫髓鞘患者的血清AQP4抗體檢測，有助于NMO和其相關(guān)綜合征的診斷。
　　 [5]通過多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外組織基質(zhì)的熒光模式比較和人臍靜脈細(xì)胞證實(shí)，結(jié)合于腦微血管的NMO-IgG的靶抗原除了AQP4外，亦可能是血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體，NMO-I

13、gG對于判斷AQP4抗體不具有絕對的特異性。
　　 [6]細(xì)胞法檢測腦脊液中AQP4抗體的診斷正確率高于血清中的檢測，兩種體液的聯(lián)合檢測可以進(jìn)一步提高診斷正確率。
　　 [7]AQP4抗體可能在CNS內(nèi)首先產(chǎn)生，而血清中的AQP4抗體出現(xiàn)是繼發(fā)性的改變。
　　 [8]臨床確診的NMO患者幾乎均與AQP4抗體相關(guān)，AQP4抗體陰性患者可能很少見，而NMO高危綜合征患者(LETM，雙側(cè)視神炎或OSMS)大部分與AQP