EphB4-Rac1-Cdc42-RhoA通路介導(dǎo)髓系白血病耐藥與高三尖杉酯堿阻斷機(jī)制研究.pdf

1、本課題來(lái)源于廣州市科技攻關(guān)計(jì)劃(No.2006Z3-E0401)和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.30973421)。
　　 背景與目的：
　　 慢性髓細(xì)胞白血病(CML)細(xì)胞中存在著9號(hào)和22號(hào)染色體相互易位產(chǎn)生的Ph染色體，形成Bcr-Abl融合基因，表達(dá)異常酪氨酸激酶活性蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致CML發(fā)病。根據(jù)CML這一特殊發(fā)病機(jī)制，一種Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制劑—伊馬替尼已成功用于臨床治療。伊馬替尼(IM)是目前CML-慢

2、性期患者標(biāo)準(zhǔn)治療方案，它能明顯改善慢性期患者5年生存期并顯著降低急變發(fā)生概率。盡管大多數(shù)慢性期CML患者采用IM治療后疾病得到有效控制，但是一部分患者病情仍會(huì)反復(fù)或由慢性期向加速期、急變期進(jìn)展。處于CML進(jìn)展期（加速期或急變期）的患者即使采取IM作為初始治療，大多數(shù)則會(huì)表現(xiàn)出對(duì)IM治療反應(yīng)不佳、耐藥、病情反復(fù)。因此研究IM耐藥機(jī)制已成為髓系白血病靶向治療的最主要問(wèn)題。
　　 產(chǎn)生IM耐藥最常見(jiàn)原因是Abl激酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生點(diǎn)突變，抑

3、制激酶與IM效應(yīng)位點(diǎn)相結(jié)合。目前報(bào)道的其他產(chǎn)生耐IM作用機(jī)制，主要包括Bcr-Abl基因序列擴(kuò)增、Bcr-Abl蛋白產(chǎn)物過(guò)表達(dá)、胞內(nèi)IM濃度下降以及其他類(lèi)型的酪氨酸激酶(PTKs)激活等。
　　 促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體(Eph)是最大的酪氨酸激酶受體蛋白家族。Eph活化后最主要生物學(xué)效應(yīng)是調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與形態(tài)形成。EphB4是受體Eph蛋白家族成員之一，在腫瘤形成、細(xì)胞間相互作用（包括細(xì)胞間連接、粘附、遷移和排斥）中起到重要

4、作用。盡管髓系白血病IM耐藥已經(jīng)被廣泛關(guān)注和研究，但很少有報(bào)道涉及Eph受體是否在產(chǎn)生IM耐藥中起到作用。近來(lái)報(bào)道，在Ph+急性淋巴細(xì)胞白血病，EphB4過(guò)表達(dá)同IM耐藥有關(guān)。本課題研究目的就是確定EphB4在髓系白血病耐IM效應(yīng)中所起的作用及其機(jī)制。
　　 Ras信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中起到必不可少的作用。Ras激酶活化后可使其下游信號(hào)蛋白磷酸化水平增高，例如MEK/ERK蛋白。目前證實(shí)在Ph染色體陽(yáng)性的急性淋巴細(xì)胞白血病和C

5、ML細(xì)胞中存在一種新型IM耐藥機(jī)制，由Ras/MEK/ERK活化產(chǎn)生的IM耐藥性。為了確定在髓系白血病中，受體EphB4過(guò)表達(dá)是否參與IM耐藥作用，我們將檢測(cè)在改變EphB4表達(dá)情況下，Ras/MAPK通路中的蛋白磷酸化水平。
　　 Rho家族小G蛋白（RhoA，Rac1和Cdc42）具有調(diào)控細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的功能。Cdc42和Rac1是細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)中最主要調(diào)控蛋白，這一作用有助于促進(jìn)Bcr-Abl活化產(chǎn)生增殖效應(yīng)。2003年，Oh

6、mine等證實(shí)RhoA激酶蛋白參與產(chǎn)生IM耐藥性。本課題組前期研究工作(國(guó)家自然科學(xué)基金:30271463)應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)對(duì)K562細(xì)胞（CML急變細(xì)胞系）基因表達(dá)差異分析發(fā)現(xiàn)，RhoA在K562-W細(xì)胞中呈低表達(dá)，而在IM耐藥的K562-R細(xì)胞中呈高表達(dá)。這表明RhoA在IM耐藥中扮演重要角色。本項(xiàng)研究中，我們同步檢測(cè)了改變EphB4表達(dá)情況下，RhoA通路蛋白活性水平的變化。
　　 高三尖杉酯堿(HHT)源自植物生物

7、堿成分，過(guò)去30年間HHT廣泛用于髓細(xì)胞白血病治療。2008年Tong等研究證實(shí)，HHT具有泛酪氨酸激酶抑制劑的活性，能夠阻斷多條白血病細(xì)胞信號(hào)通路。在出現(xiàn)異常酪氨酸激酶激活的髓細(xì)胞白血病治療中，HHT具有十分重要作用。2011年，我們?cè)u(píng)估了以HHT作為一線方案治療老年AML(初發(fā)或繼發(fā)AML)的療效及安全性。結(jié)果證實(shí)HHT作為誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后的一線治療方案不僅有助于延長(zhǎng)患者總生存期，而且較蒽環(huán)類(lèi)藥物更為安全可靠。2010年Fang等相關(guān)研

8、究認(rèn)為，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)劑量IM治療反應(yīng)不佳的CML進(jìn)展期患者，HHT+IM方案能夠再次誘導(dǎo)患者獲得血液學(xué)緩解，部分甚至可獲得遺傳學(xué)緩解。
　　 HHT通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞蛋白合成實(shí)現(xiàn)了治療急性髓系白血病的作用，但HHT聯(lián)合IM治療進(jìn)展/耐藥CML機(jī)制并不十分明確。2004年本研究小組成員通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析及質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，HHT作用于K562細(xì)胞后，DJ-1蛋白質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)。String在線軟件(http://string-db.org/)分析

9、發(fā)現(xiàn)，DJ-1蛋白能夠抑制EphB4蛋白表達(dá)。這提示我們，HHT可能會(huì)抑制K562細(xì)胞中EphB4表達(dá)。
　　 前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)中，我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EphB4高表達(dá)于K562-R細(xì)胞株，進(jìn)一步建立了穩(wěn)定低表達(dá)EphB4的K562-耐藥細(xì)胞株（K562-R-EphB4-sh，通過(guò)ABI在線軟件設(shè)計(jì)出EphB4的反義RNA寡核苷酸序列，構(gòu)建慢病毒載體、轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，直接感染K562-R細(xì)胞得到低表達(dá)EphB4的穩(wěn)定細(xì)胞株）。本課題研究目

10、標(biāo)就是闡述EphB4在伊馬替尼耐藥中的角色及其作用機(jī)制，探索HHT是否下調(diào)EphB4效應(yīng)途徑的表達(dá)水平。
　　 研究方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 10％小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)K562-W(CML急變期細(xì)胞株，多探針熒光原位雜交檢測(cè)顯示表達(dá)Bcr-Abl融合基因)細(xì)胞。耐IM的K562-R細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)加入濃度為5.45mg/L的IM。所有細(xì)胞株均在南方醫(yī)院血液科實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行

11、實(shí)驗(yàn)。
　　 2.MTT測(cè)定
　　 分別取K562-W、K562-R和K562-R-EphB4-sh細(xì)胞，按0.5×104/孔濃度加于96孔培養(yǎng)板；100毫升培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別在不同濃度梯度IM（0-8mg/L）孵育24小時(shí)。每孔加入5mg/ml濃度的噻唑蘭(MTT)20ul，測(cè)定細(xì)胞抑制率，對(duì)照組內(nèi)加入等濃度的DMSO（100ug/孔）。細(xì)胞增殖抑制率(％)=（1-（處理組-調(diào)零孔）/（對(duì)照組-調(diào)零孔））×100％。不同

12、細(xì)胞株之間IC50比值即為細(xì)胞的相對(duì)耐藥倍數(shù)。HHT作用下，IM對(duì)于K562-R細(xì)胞增殖抑制率，也用MTT法測(cè)定。
　　 3.移植物模型
　　 本研究使用BALB/C雌性裸鼠(4-5周齡，斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)。一次性在裸鼠側(cè)背部皮下接種K562-W、K562-R和K562-R-EphB4-sh細(xì)胞液100微升(接種細(xì)胞數(shù)量達(dá)到107)。微米卡尺測(cè)量測(cè)量腫塊長(zhǎng)短徑，計(jì)算腫瘤體積=長(zhǎng)徑×短徑2/2。
　　 4

13、.半定量PCR分析
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株，用Trizol分離RNA，ABI9700儀器進(jìn)行半定量PCR檢測(cè)。Primer5.0軟件設(shè)計(jì)待擴(kuò)增的引物序列。
　　 EphB4-上游引物:5’—ACTCCTTCCTGCGGCTAA—3';
　　 EphB4-下游引物:5’—AGACGAGGTTGCTGTTGACT—3。
　　 5.WesternBlot分析
　　 RIPA裂解液提取組織細(xì)胞總

14、蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。目的蛋白采用SDS-PAGE電泳法分離、轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF膜。5％脫脂乳（或牛血清白蛋白）溶液搖床封閉2小時(shí);5％BSA溶液稀釋磷酸化蛋白一抗(1:1000)，4℃過(guò)夜。主要使用的血清抗體包括:抗EphB4抗體（R&D，美國(guó)），抗磷酸化Rac1+Cdc42抗體（cst，美國(guó)），抗磷酸化RhoA抗體（cst，美國(guó)），抗磷酸化ERK1/2抗體（cst，美國(guó)），抗磷酸化MEK1/2抗體（cst，美國(guó)）和抗β-act

15、in抗體(SantaCruz生物公司，美國(guó))。洗脫后，5％血清白蛋白稀釋HRP-結(jié)合羊抗鼠或鼠抗羊/兔免疫球蛋白(1/5000)，孵育PVDF膜1小時(shí)。再次洗脫后，使用增強(qiáng)發(fā)光劑顯影二抗。
　　 6.PEAnnexinV凋亡檢測(cè)
　　 用含有7-氨基放線菌素D成分的PEAnnexinV染色試劑盒檢測(cè)K562-R細(xì)胞分別在HHT、IM和HHT+IM作用下的凋亡率，流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)結(jié)果。
　　 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

16、>　　 數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件處理。全程實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述。對(duì)比各移植瘤分組之間體積差異、不同細(xì)胞株及其移植瘤組織間蛋白磷酸化水平及其mRNA檢測(cè)結(jié)果比較采用單因素方差分析。IM、HHT干預(yù)后的細(xì)胞及其移植瘤組織蛋白磷酸化表達(dá)對(duì)比，采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.K562-R-EphB4-sh細(xì)胞中EphB4表達(dá)水平顯著下降
　　 采用半

17、定量PCR和Westernblot技術(shù)來(lái)確認(rèn)不同細(xì)胞株中EphB4mRNA和蛋白的表達(dá)水平。與K562-W細(xì)胞相比，耐IM的K562-R細(xì)胞高表達(dá)EphB4受體。但在導(dǎo)入EphB4mRNA干擾序列的K562-R-EphB4-sh細(xì)胞中，EphB4mRNA表達(dá)水平顯著低于K562-R（多重比較，P＜0.001）和K562-W細(xì)胞(多重比較，P=0.006)，相應(yīng)的EphB4蛋白表達(dá)水平也顯著低于K562-R（多重比較，P＜0.001）和K

18、562-W細(xì)胞（多重比較，P＜0.001），這表明K562-R-EphB4-sh細(xì)胞株建立成功。
　　 2.K562-R-EphB4-sh細(xì)胞恢復(fù)對(duì)伊馬替尼的敏感性
　　 MTT法分析K562-R-EphB4-sh細(xì)胞對(duì)IM的耐受劑量。結(jié)果顯示K562-R-EphB4-sh(IC500.93mg/L)細(xì)胞對(duì)IM敏感性顯著高于K562-R細(xì)胞（IC505.45mg/L，多重比較P＜0.001）。隨著EphB4表達(dá)下調(diào)，K5

19、62-R-EphB4-sh細(xì)胞對(duì)IM耐藥性降低，但其敏感性尚未達(dá)到K562-W細(xì)胞的水平(IC500.16mg/L，多重比較P＝0.013)。
　　 3.建立K562細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型
　　 裸鼠皮下接種細(xì)胞后30天，移植瘤體積大小超過(guò)1000mm3。體積均值分別為K562-W移植瘤1588.78±210.89mm3，K562-R移植瘤1631.134±454.57mm3和K562-R-EphB4-sh移植瘤1710

20、.60±266.41mm3(F=0.249，P=0.782)。剖取3組移植瘤組織進(jìn)行病理學(xué)鑒定，熒光顯微鏡下可見(jiàn)K562-R-EphB4-sh組織細(xì)胞有綠色熒光反應(yīng)，證實(shí)移植瘤造模成功。
　　 4.K562-R-EphB4-sh細(xì)移植瘤對(duì)伊馬替尼治療敏感
　　 對(duì)比K562-W，K562-R和K562-R-EphB4-sh移植瘤成瘤體積和生存數(shù)目。移植瘤成功建立后，3組裸鼠移植瘤(N=6/組)開(kāi)始口服標(biāo)準(zhǔn)劑量的IM（91

21、ug/g體重，療程30天）治療。干預(yù)治療后K562-W裸鼠移植瘤體積較治療前顯著回縮（806.15±202.31mm3對(duì)比1586.73±230.94mm3，t=12.539，P＜0.001）。低表達(dá)EphB4的K562-R-EphB4-sh移植瘤體積均值較治療前無(wú)顯著差異（1630.16±412.01mm3對(duì)比1720.06±290.54mm3，t=0.922，P=0.399）。K562-R移植瘤治療后體積均值繼續(xù)顯著增加(2301.

22、25±555.76mm3對(duì)比1733.82±399.22mm3，t=-6.452，P＝0.001)。治療終止后統(tǒng)計(jì)3組移植瘤裸鼠(N=6/組)死亡數(shù)目，其中K562-R移植瘤裸鼠在完成全療程(30天)IM治療前全部死亡（6只），K562-W移植瘤裸鼠死亡2只，K562-R-EphB4-sh移植瘤裸鼠死亡4只。從移植瘤體積和裸鼠生存數(shù)目來(lái)看，K562-R-EphB4-sh移植瘤接受口服IM治療療效較K562-R移植瘤更為顯著。
　　

23、 5.K562-R-EphB4-sh細(xì)胞及其移植瘤中信號(hào)蛋白的磷酸化水平
　　 在K562-W，K562-R和K562-R-EphB4-sh細(xì)胞及其移植瘤組織中，我們檢測(cè)了一系列可能相關(guān)的信號(hào)蛋白活性水平（Ras/MEK/ERK和Racl/Cdc42/RhoA通路）。在3個(gè)細(xì)胞株中，Ras-GTPase均為高表達(dá)(F=0.948，P=0.439)。K562-R和K562-R-EphB4-sh細(xì)胞中MEK和ERK信號(hào)磷酸化水平顯

24、著高于K562-W細(xì)胞（多重比較均為P＜0.001）。而在K562-R細(xì)胞，Rac1+Cdc42和RhoA磷酸化水平顯著高于K562-R-EphB4-sh和K562-W細(xì)胞（多重比較均為P＜0.001）。
　　 移植瘤組織檢測(cè)證實(shí)活性蛋白表達(dá)情況與細(xì)胞株水平一致。K562-R移植瘤組織高表達(dá)EphB4，K562-R-EphB4-sh移植瘤組織則顯著低表達(dá)EphB4（多重比較P＜0.001）。與K562-W移植瘤組織相比，MEK和

25、ERK蛋白磷酸化水平在K562-R-EphB4-sh和K562-R組織均顯著增高（多重比較均為P＜0.001），而Rac1+Cdc42和RhoA磷酸化水平在K562-R移植瘤組織中顯著高于K562-R-EphB4-sh和K562-W移植瘤組織（多重比較均為P＜0.001）。
　　 6.HHT聯(lián)合伊馬替尼能夠增強(qiáng)對(duì)K562-R細(xì)胞的凋亡和增殖抑制率
　　 PEAnnexinV凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，在IM(1.2mg/L)作用下

26、K562-R細(xì)胞凋亡率僅為2.35±0.11％，顯著低于K562-W細(xì)胞(71.82±1.94％，多重比較P=0.001)。但在HHT(20ug/L)聯(lián)合IM作用下，K562-R細(xì)胞凋亡率增加到58.71±2.39％，顯著高于單獨(dú)IM孵育下的K562-R細(xì)胞(多重比較，P＝0.002)。我們測(cè)定K562-R細(xì)胞對(duì)于伊馬替尼IC50值為5.45mg/L，在HHT20ug/L濃度干預(yù)下，K562-R細(xì)胞株對(duì)伊馬替尼的IC50均值由5.45下

27、降至1.17mg/L(t=15.271，P＜0.001)。
　　 7.K562-R移植瘤裸鼠接受HHT聯(lián)合IM方案治療更有效
　　 K562-R移植瘤裸鼠分為3個(gè)治療組(N=6/組)分別接受HHT，IM和HHT+IM方案治療。接受HHT+IM方案治療的裸鼠移植瘤體積較治療前顯著下降(1692.82±317.14mm3對(duì)比975.56±132.42mm3，t=8.637，P＜0.001)。反之，接受單一IM方案治療的K56

28、2-R移植瘤裸鼠體積較治療前顯著增加(1733.82±399.22mm3對(duì)比2301.25±555.76mm3，t=-6.452，P=0.001)。治療終止（4周）統(tǒng)計(jì)3組移植瘤裸鼠(N=6/組)死亡數(shù)目，其中伊馬替尼治療組移植瘤裸鼠在完成全療程（4周）IM治療前全部死亡（6只），HHT單藥治療組移植瘤裸鼠死亡5只，HHT+IM治療組移植瘤裸鼠死亡1只。從移植瘤體積變化和裸鼠生存數(shù)目來(lái)看，HHT聯(lián)合IM方案較單一使用IM或HHT的方案治

29、療K562-R移植瘤更加有效。
　　 8.HHT阻斷EphB4/Rac1/Cdc42/RhoA傳導(dǎo)通路
　　 對(duì)于HHT干預(yù)后的K562-R細(xì)胞及其移植瘤組織，我們進(jìn)行了EphB4/Rac1/Cdc42/RhoA和MEK/ERK通路蛋白的檢測(cè)。HHT(20ug/L)孵育后，K562-R細(xì)胞中的受體EphB4蛋白、Rac1+Cdc42和RhoA磷酸化蛋白表達(dá)顯著下降(t＝49.730，P＜0.001和t=23.507，P＝

30、0.002和t=86.554，P＜0.001)，但MEK/ERK信號(hào)蛋白磷酸化水平在HHT干預(yù)前后均維持高水平表達(dá)(t=1.296，P=0.324和t=-1.147，P=0.370)。與HHT干預(yù)作用不同的是，阿霉素(1mg/L)孵育前后，EphB4(t=1.644，P=0.242)、Rac1+Cdc42(t=2.203，P＝0.158)和RhoA(t=-3.538，P＝0.071)蛋白磷酸化均成高水平表達(dá)，阿霉素干預(yù)后沒(méi)有使EphB4

31、/Rac1/Cdc42/RhoA通路表達(dá)活性下降。
　　 移植物組織蛋白測(cè)定結(jié)果與細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果一致。EphB4和磷酸化的Rac1+Cdc42、RhoA蛋白在IM治療后的表達(dá)水平仍顯著高于HHT和HHT+IM方案治療組（多重比較均為P＜0.001）。在細(xì)胞和組織中，均證實(shí)經(jīng)過(guò)含有HHT方案干預(yù)治療后，EphB4/Rac1/Cdc42/RhoA蛋白表達(dá)水平較IM治療組顯著下降。
　　 結(jié)論：
　　 1.采用BALB/

32、C雌性裸鼠皮下建立K562-W，K562-R和K562-R-EphB4-sh移植瘤技術(shù)成熟、穩(wěn)定可靠。
　　 2.在耐受伊馬替尼的K562-R細(xì)胞中EphB4過(guò)表達(dá)。而低表達(dá)EphB4的K562-R-EphB4-sh細(xì)胞，對(duì)IM敏感性得到明顯恢復(fù)。K562-R-EphB4-sh移植瘤裸鼠，接受IM治療后其療效明顯好于K562-R移植瘤裸鼠。我們首次認(rèn)定EphB4過(guò)表達(dá)是IM耐藥性產(chǎn)生的重要因子。
　　 3.信號(hào)蛋白檢測(cè)，

33、MEK/ERK通路蛋白活性并沒(méi)有隨著EphB4表達(dá)下調(diào)而出現(xiàn)變化。MEK/ERK通路磷酸化水平在K562-R和K562-R-EphB4-sh細(xì)胞株及其移植瘤組織之間均呈高表達(dá)。MEK/ERK通路活性水平未受到EphB4蛋白表達(dá)強(qiáng)度變化的影響。與K562-R細(xì)胞及其移植瘤組織對(duì)比，在K562-R-EphB4-sh細(xì)胞株和移植瘤組織中，RhoA和Rac1+Cdc42磷酸化表達(dá)水平同步下降。通過(guò)細(xì)胞株及其移植瘤相關(guān)耐藥信號(hào)途徑檢測(cè)，我們首次發(fā)

34、現(xiàn)在髓細(xì)胞白血病可能存在一個(gè)新的IM耐藥途徑:EphB4過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的Rac1/Cdc42/RhoA通路。
　　 4.HHT聯(lián)合IM能夠顯著增加K562-R細(xì)胞凋亡率與增殖抑制率。與單藥使用IM或高三尖杉酯堿相比，HHT聯(lián)合IM的治療方案能夠顯著縮小K562-R移植瘤體積，增加裸鼠生存數(shù)目。HHT+IM方案在K562-R移植瘤裸鼠的治療反應(yīng)較任一單藥組更為有效。
　　 5.磷酸化蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，而HHT干預(yù)K562-R細(xì)