高三尖杉酯堿對人白血病細(xì)胞JAK2-STAT5相關(guān)信號通路的影響及其機制的研究.pdf

1、許多細(xì)胞因子和生長因子通過JAK/STAT途徑傳導(dǎo)信號,其中JAN2與造血關(guān)系最為密切,STAT5(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子)是JAK2最主要的下游信號蛋白。STAT5被JAK2磷酸化后形成二聚體,進入核內(nèi),調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,維持細(xì)胞的生長分化與增殖。急性髓系白血病常與染色體異常以及致癌蛋白的形成密切相關(guān),它們激活惡性細(xì)胞存活與增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中,某些基因的過渡表達(dá)或突變引起的JAK2-STAT5信號途徑的持續(xù)激活

2、對髓系原始細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化猶為重要,因此藥物阻斷JAK2-STAT5信號途徑進而抑制AML細(xì)胞的惡性增殖已經(jīng)成為AML靶向治療的重要組成部分。高三尖杉酯堿是一種具有抗白血病活性的植物堿,自二十世紀(jì)七十年代以來,在中國已經(jīng)廣泛應(yīng)用于急慢性白血病和骨髓異常增生綜合癥的治療,并取得顯著療效。盡管幾個細(xì)胞學(xué)事件已經(jīng)確定與其抗白血病效應(yīng)相關(guān),包括:抑制蛋白合成和端粒酶活性,下調(diào)Mcl-1,Survivin,內(nèi)皮生長因子等與細(xì)胞的惡性密切相關(guān)的因子的

3、表達(dá),上調(diào)前凋亡蛋白Bax的表達(dá)和Caspase-3介導(dǎo)的PARP的剪切等等,但HHT對JAK2-STAT5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響的相關(guān)研究尚未見報道。我們的研究中,分離AML病人骨髓單個核細(xì)胞,與0,20,40,80ng/ml的HHT共同培養(yǎng)48小時后采用MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltelra-zolium bromide)比色法觀察HHT對AML原代細(xì)胞的生長抑制作用,結(jié)果發(fā)

4、現(xiàn):HHT對AML病人原代細(xì)胞具有顯著生長抑制作用,呈濃度依賴性(20,40,80ng/ml的HHT的抑制率分別為16.49±2.70％,24.81±5.49%,47.58±4.31%),對健康者骨髓抑制作用不明顯(抑制率分別為5.56±1.37%,7.41±2.13%,12.04±3.21%)。進一步研究HHT對AML細(xì)胞株HEL,K562,HL-60的生長抑制作用:HHT對HEL作用48小時的半數(shù)抑制濃度(IC50)為64.74ng

5、/ml,對K562細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為116.5ng/ml,HL-60為77.3ng/ml.我們同時也觀察了HHT對HEL細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用:0,10,20,40,80,160ng/mlHHT處理HEL48小時后,40ng/ml的HHT作用即開始產(chǎn)生DNA ladder,隨著HHT濃度的增加,產(chǎn)生的條帶越多.流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn):0,10,20,40,80ng/mlHHT作用HEL細(xì)胞24h后PI及AnnexinV染色,HHT誘導(dǎo)HEL細(xì)

6、胞凋亡呈濃度依賴方式,10,20,40,80ng/ml組細(xì)胞凋亡率分別為5.14±0.28%、10.58±0.22%、24.4±2.01%及39.61±2.66%,均明顯高于對照組(1.51%).早期的研究發(fā)現(xiàn),慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞Bcr-Abl融合蛋白能激活JAK2-STAT5信號途徑,甚至MAPK,PI3K等生長途徑。JAK2V617F突變在MPD病人中能引起多種信號途徑的組成性激活(JAK-STAT,MAPK,PI3K)等,其中主

7、要是STAT5,被JAK2磷酸化激活后能激活多種基因的轉(zhuǎn)錄,包括Bcl-xl,一種過渡表達(dá)于PV患者紅系祖細(xì)胞的抗凋亡蛋白,在細(xì)胞增殖和存活方面起重要作用。我們假設(shè)HHT主要在蛋白水平影響JAK2-STAT5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Western blot檢測了HHT對JAK2-STAT5信號途徑中蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示:不同濃度的HHT作用AML原代細(xì)胞,HEL,K5626小時后,JAK2,STAT5總蛋白水平無顯著改變,但其磷酸化水平明顯下

8、調(diào),且呈濃度依賴性(K562細(xì)胞中,JAK2表達(dá)也下調(diào))。而RT-PCR結(jié)果提示JAK2,STAT5在mRNA水平都無改變。進一步的研究顯示:6小時后,HEL中Bcl-xL的表達(dá)無變化,而將時間延長致24小時后,Bcl-xL表達(dá)下調(diào),在mRNA水平也呈濃度依賴性下調(diào)。試驗結(jié)果初步提示:HHT是通過抑制蛋白酪氨酸激酶(PTK)的活性阻斷JAK2-STAT5信號通路的磷酸化,進而抑制與細(xì)胞惡性增長相關(guān)的通路達(dá)到抑制增長和誘導(dǎo)凋亡的。由于AM

9、L原代細(xì)胞及細(xì)胞株中也都有MAPK和PI3K途徑的激活,我們也同時觀察了HHT作用于HEL,K562細(xì)胞株后這兩個信號通路在蛋白水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):不同濃度的HHT作用HEL,K562細(xì)胞后,在AKT,ERK1/2總水平恒定的情況下,AKT的磷酸化水平呈劑量依賴性下調(diào),可能與JAK2是通過BCR-ABL/JAK2/Gab2/PI3K/AKT網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)AKT活性相關(guān),當(dāng)JAK2活性受到抑制時,AKT的磷酸化水平也下調(diào)。但ERK1/2的磷酸

10、化水平則無顯著變化,具體機制尚不清楚,或許其他的錨定蛋白如Grb2,Gab2等也參與ERK1/2活性的調(diào)節(jié)有關(guān)。為了進一步證實HHT是通過抑制JAK2-STAT5通路的信號蛋白酪氨酸磷酸化實現(xiàn)其效應(yīng)的,我們觀察JAK2特異性抑制劑AG490單獨以及與HHT協(xié)同作用HEL,K562細(xì)胞的效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):AG490單獨以及與HHT共同作用這兩種細(xì)胞后,均能誘導(dǎo)凋亡,WB檢測也發(fā)現(xiàn),HEL中,JAK2,STAT5磷酸化水平下調(diào),而K562細(xì)胞

11、株中,JAK2磷酸化水平下調(diào),但STAT5的磷酸化無顯著變化,可能與K562細(xì)胞株中JAK2和STAT5是由Bcr/Abl分別激活有關(guān)。也進一步提示HHT不僅只作用于JAK2,而是作為一種廣譜的PTK抑制劑在阻斷JAK2-STAT相關(guān)信號通路中發(fā)揮作用。綜上所述,我們的研究結(jié)果表明:(1)HHT對急性髓系白血病原代細(xì)胞以及細(xì)胞株HEL,K562和HL-60細(xì)胞有顯著的生長抑制作用。這種生長抑制作用呈劑量依賴性。(2)10ng/mlHHT

12、即可誘導(dǎo)HEL的早期凋亡,10,20,40,80ng/ml組細(xì)胞凋亡率分別為5.14±0.28%、10.58±0.22%、24.4±2.01%及39.61±2.66%,均明顯高于對照組(1.51%).但DNA ladder發(fā)現(xiàn)在40ng/ml時開始出現(xiàn)凋亡條帶,且HHT濃度越大,凋亡條帶越多。(3)不同濃度的HHT作用AML原代細(xì)胞,HEL,K5626小時后,JAK2,STAT5總蛋白水平無顯著改變,但其磷酸化水平明顯下調(diào),且呈濃度依賴

13、性(K562細(xì)胞中,JAK2表達(dá)也下調(diào))。而RT-PCR結(jié)果提示JAK2,STAT5在mRNA水平都無改變。進一步的研究顯示:6小時后,HEL中Bcl-xL的表達(dá)無變化,而將時間延長致24小時后,Bcl-xL表達(dá)下調(diào),在mRNA水平也呈濃度依賴性下調(diào)。此外,經(jīng)不同濃度HHT作用6小時后HEL與K562細(xì)胞中AKT的磷酸化水平都下調(diào),但ERK1/2磷酸化無顯著變化。(4)JAK2特異性抑制劑AG490單獨以及與HHT共同作用這兩種細(xì)胞后,