蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析妊娠期高血壓孕婦尿液分子標記物的研究.pdf

1、一、研究背景:
　　1.妊娠期高血壓
　　妊娠期高血壓(Gestational hypertension)是妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy)的一種,是妊娠期特有的以血壓升高為主要臨床特征的一種疾病,單純而嚴重的妊娠期高血壓孕婦,雖無蛋白尿,母兒患病率較高,甚至高于輕度子癇前期患者[1]。臨床上約25％～50%最開始診斷為妊娠期高血壓者,可以進展為子癇

2、前期-子癇,并且妊娠期高血壓的發(fā)病越早,其進展為子癇前期-子癇的可能性越大,可導致孕產(chǎn)婦腦血管意外、子癇、圍產(chǎn)兒早產(chǎn)、甚至死亡等不良妊娠結(jié)局,其對孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒造成的危害日益受到人們的認識和關(guān)注;在我國,妊娠期高血壓疾病是導致孕產(chǎn)婦及新生兒死亡的主要原因之一,嚴重危害母嬰健康[2]。近年來,國內(nèi)外學者通過免疫、基因等方面的研究,對妊娠期高血壓疾病的某些發(fā)病因素有所了解,但其發(fā)病機理仍未全面闡明,也缺乏有效、全面的特異性檢測指標和方法,用

3、于預(yù)防、早期篩查該疾病,以及預(yù)測其嚴重程度[3,4]。因此尋求妊娠期高血壓疾病特異性的分子標記物,進一步闡明其發(fā)病機制,實現(xiàn)早期診斷及預(yù)測妊娠期高血壓疾病是近年來產(chǎn)科研究的熱點。
　　2.蛋白質(zhì)組學研究方法
　　蛋白質(zhì)組學是以一個細胞、組織或體液中,全部表達的蛋白質(zhì)為研究對象;是當前生命科學研究中的前沿領(lǐng)域,是實現(xiàn)機體蛋白質(zhì)的全面、快速、準確的鑒定研究中必不可少的關(guān)鍵性技術(shù)之一。機體內(nèi)細胞或組織等內(nèi)的蛋白質(zhì)組細微的變化,就可

4、以引起機體內(nèi)某些重要通路的抑制或激活,進而可能導致細胞的變異或者分裂,蛋白質(zhì)組作為機體一個高度動態(tài)的系統(tǒng),蛋白質(zhì)豐度的變化,是許多諸如心血管疾病、癌癥等疾病發(fā)病過程中的重要標志,研究病變細胞相對于機體正常細胞中蛋白質(zhì)表達豐度的變化,發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的生物標志物對實現(xiàn)疾病的早期診斷及早期預(yù)測,具有十分重要的意義[5]。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學在臨床方面,可以研究特異蛋白質(zhì)與疾病的關(guān)系,從而找到疾病的標記蛋白,為臨床提供新的診斷依據(jù)[6]。蛋白質(zhì)組學的特

5、點是采用高通量的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù),結(jié)合高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù),全面地研究在生理及病理等各種特定情況下,機體動態(tài)表達的全部蛋白質(zhì)的整體變化。
　　3.蛋白質(zhì)組學在臨床中的應(yīng)用
　　蛋白質(zhì)組學技術(shù)的應(yīng)用,在臨床領(lǐng)域中還僅僅局限于篩選疾病相關(guān)的特異性標志物。蛋白質(zhì)組學研究中應(yīng)用最多是在腫瘤相關(guān)方面,蛋白質(zhì)組學不僅為其提供了一個新的方法以研究腫瘤的發(fā)病機制,而且利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜可以進行腫瘤的早期診斷及判斷患者的預(yù)后,判斷有些特異體質(zhì)的

6、患者治療后的機體反應(yīng),用于判斷機體的耐藥性。另外,蛋白質(zhì)組學也較多的應(yīng)用于新藥開發(fā)中。通過比較正常細胞與疾病細胞中的蛋白質(zhì)組,尋找一些疾病相關(guān)的蛋白質(zhì),并將這些蛋白質(zhì)作為疾病診斷的的關(guān)鍵點。國內(nèi)研究學者[7]應(yīng)用蛋白質(zhì)組學方法,分析正常4例人尿液蛋白質(zhì)組成成分,初步建立了正常人尿液的蛋白質(zhì)圖譜,為分析病理情況下尿液蛋白質(zhì)成分的改變提供了基礎(chǔ)資料,為今后研究病理情況與生理情況下尿液蛋白質(zhì)組的差異提供依據(jù)。俞麗麗等[8]運用蛋白質(zhì)組學的方法

7、,建立了妊娠期高血壓疾病與正常妊娠孕婦的血清蛋白質(zhì)譜圖,進一步比較兩組,發(fā)現(xiàn)二者之間存在差異的5個質(zhì)荷比相對應(yīng)蛋白質(zhì),這5個質(zhì)荷比相對應(yīng)的蛋白質(zhì)有可能成為早期篩查妊娠期高血壓疾病的血清學標志物。國外研究者[9]利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)建立了檢測早期卵巢癌的血清蛋白質(zhì)圖譜;國外學者[10]篩選了葡萄胎組織的蛋白質(zhì)圖譜,發(fā)現(xiàn)3種金屬結(jié)合多肽的表達量明顯少于對照組。研究也發(fā)現(xiàn)[11]在胎膜早破患者血清蛋白質(zhì)圖譜中,發(fā)現(xiàn)了兩種未知功能的蛋白質(zhì),認為這

8、兩種未知蛋白質(zhì)可能是胎膜早破診斷的特異性生物標志物。
　　4.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜
　　在蛋白質(zhì)組學研究中,生物質(zhì)譜已成為蛋白組大規(guī)模分析的強有力工具,是近年來新興的一種技術(shù),應(yīng)用日益廣泛。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜是近年來發(fā)展起來的,新型的軟電離生物質(zhì)譜的一種,主要由基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源(MALDI)及飛行時間質(zhì)量分析器(TOF)兩部分組成。MALDI-TOF-MS具有特異度高、靈敏度高及分辨率高等

9、特點。國內(nèi)外眾多研究者,應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù),發(fā)現(xiàn)了許多對疾病診斷、治療以及預(yù)后有重要作用的疾病標志物[12-15]。為生命科學等領(lǐng)域提供了一種強有力的分析測試手段,扮演著越來越重要的作用。
　　5.尿液蛋白質(zhì)組學的優(yōu)勢
　　臨床上尿液與羊水、胎盤等其他體液樣本相比,蛋白組成相對簡單、易于分析,且尿液獲得相對無創(chuàng)、收集便利,并能在一定程度上,反映血液和整個機體的狀態(tài),同時尿液的復雜度低于血液等樣品,更容易

10、觀察其中的低豐度蛋白的變化,有利于疾病標志物的檢出[16],是疾病重要的標志物來源?！澳虻鞍踪|(zhì)組學”(urinaryProteomic)運用高通量的蛋白質(zhì)組學技術(shù),實現(xiàn)了尿液蛋白質(zhì)全面的、準確及快速的分析,鑒定出差異蛋白;研究尿液蛋白質(zhì)成分的改變,還可用于解釋生理學代謝、毒理及許多疾病的進展過程,有助于闡明疾病的發(fā)病機制、尋找早期診斷的生物學標記物。鑒于尿液蛋白質(zhì)組學的以上優(yōu)點,國內(nèi)外學者目前熱衷于對生理和疾病狀態(tài)下的尿液進行蛋白質(zhì)組學

11、分析,獲得了正常人尿液的標準蛋白圖譜[17,18]、并研究機體尿液蛋白在不同疾病狀態(tài)下的整體變化[19-21]。
　　應(yīng)用蛋白質(zhì)組學在臨床方面可以研究特定蛋白與疾病的關(guān)系,從而找到疾病標記蛋白,為臨床提供新的診斷依據(jù)。蛋白質(zhì)組學方法中基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時間/飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)具有靈敏度高、特異度高等優(yōu)越性。臨床上尿液與血清等其他體液樣本相比,其獲取無創(chuàng)、收集便利,蛋白組成分相對簡單、易于分析。國內(nèi)外

12、學者也做了大量尿液蛋白質(zhì)組學研究[22-24],技術(shù)相對成熟。在此研究背景下,本實驗采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)技術(shù),對妊娠期高血壓孕婦和正常孕婦尿液蛋白質(zhì)進行對比分析。
　　二、研究目的:
　　旨在篩選妊娠期高血壓孕婦尿液中的特異性生物標志物,建立正常孕婦及妊娠

13、期高血壓孕婦尿液蛋白質(zhì)指紋圖譜模型,并探討其意義。如果在早孕期間,這些蛋白質(zhì)有表達并能夠檢測出來,則有利于妊娠期高血壓高危人群的早期篩查,為早期篩查妊娠期高血壓提供思路和方法。如果進一步研究這些蛋白質(zhì)的功能,有可能闡明妊娠期高血壓的發(fā)病機理。初步探討這些差異蛋白是否可以作為妊娠期高血壓的生物標志物,甚至是妊娠期高血壓疾病的診斷標志物,尋找與妊娠期高血壓疾病診斷相關(guān)的疾病標志物,以后將其運用于早期診斷妊娠期高血壓疾病。
　　三、材料

14、與方法:
　　1.妊娠期高血壓與正常妊娠孕婦尿液蛋白質(zhì)組分析
　　1.1、實驗分組
　　選擇2011年9～12月在南方醫(yī)科大學附屬深圳婦幼保健院住院的孕晚期孕婦共20例。正常健康足月妊娠孕婦10例,妊娠期高血壓組10例,妊娠期高血壓診斷參考第7版《婦產(chǎn)科學》,(妊娠期高血壓診斷標準:妊娠期首次出現(xiàn)BP≥140/90mmHg,并于產(chǎn)后12周恢復正常,尿蛋白(-),少數(shù)患者可伴上腹不適或血小板減少,產(chǎn)后方可確診),入選對象

15、均排除其他妊娠合并癥及并發(fā)癥。各組孕婦之間年齡、孕周、孕產(chǎn)次均無統(tǒng)計學差異。
　　1.2、實驗方法
　　尿液樣品經(jīng)濃縮、蛋白純化后蛋白定量分析,建立熒光差異凝膠雙向電泳(DIGE)圖譜;DeCyderV6.5分析軟件篩選差異蛋白質(zhì);基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)質(zhì)譜儀進行肽指紋圖譜鑒定,通過Mascot軟件進行數(shù)據(jù)庫搜索,得到蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果。
　　2.激肽原1在妊娠期高血壓疾病孕婦尿液中的表達<

16、br>　　2.1、實驗分組
　　選擇2012年2～6月在南方醫(yī)科大學附屬深圳婦幼保健院住院的妊娠期高血壓疾病組60例(妊娠期高血壓組、輕度子癇前期組、重度子癇前期組孕婦各20例)及正常妊娠對照組尿液20例,入選對象均排除其他妊娠合并癥及并發(fā)癥。各組孕婦之間年齡、孕周、孕產(chǎn)次均無統(tǒng)計學差異。
　　2.2、實驗方法
　　蛋白質(zhì)組學結(jié)果中的差異蛋白激肽原1,用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定妊娠期高血壓疾病各組與正常妊娠組尿液中激肽原1

17、含量。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行處理:數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±S)表示,P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。
　　四、結(jié)果:
　　1.妊娠期高血壓與正常妊娠孕婦尿液蛋白質(zhì)組分析
　　利用Image Master 2D Platinum 6.0軟件進行點檢測、圖像的強度校正、匹配等分析,根據(jù)國際標準,以1.5倍為標準,妊娠期高血壓與正常妊娠組相比(G/N),共檢測出45個差異點;對45個差異蛋白點進行酶解、MALDI

18、-TOF/TOF分析,通過Mascot軟件檢索SwissProt數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白,妊娠期高血壓和正常對照組的尿液總蛋白含量相比(G/N),去除未鑒定出來和鑒定結(jié)果相同的蛋白,共鑒定出22種蛋白質(zhì),其中上調(diào)的蛋白有L-型前列腺素D合成酶等14種,下調(diào)的有激肽原1等8種;蛋白評分為100%,鑒定結(jié)果高度可信。
　　2.激肽原1在妊娠期高血壓疾病孕婦尿液中的表達
　　激肽原1酶聯(lián)免疫吸附試驗結(jié)果證實,妊娠期高血壓疾病各組較正常妊娠組

19、尿液中激肽原1含量下降,P<0.05,差異均具有統(tǒng)計學意義。
　　五、結(jié)論:
　　應(yīng)用蛋白質(zhì)組學技術(shù)成功篩選出妊娠期高血壓孕婦與正常孕婦尿液中存在激肽原1等22種差異蛋白,并運用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)驗證了妊娠期高血壓疾病(妊娠期高血壓、輕度子癇前期、重度子癇前期)及正常妊娠對照組孕婦尿液中激肽原1含量,其中妊娠期高血壓組與正常妊娠組結(jié)果與蛋白質(zhì)組