妊娠期高血壓疾病的尿液差異蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、妊娠高血壓疾病在我國發(fā)病率為9.4％-10.4％，該疾病可導致孕婦全身各臟器損傷以及胎兒生長受限、胎死宮內(nèi)等嚴重并發(fā)癥，是引起孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的主要原因之一，在發(fā)展中國家因子癇前期死亡的孕婦占20％-80％，發(fā)達國家子癇前期孕婦圍產(chǎn)期死亡率為未患子癇前期疾病孕婦的5倍。
　　 近百年的研究使人類對該疾病有了一定認識，但其病因和發(fā)病機制錯綜復雜，至今仍不明確，因此目前仍無有效的預(yù)防、早期篩查以及預(yù)測疾病嚴重程度的方法，尋找能早期

2、篩查該疾病并預(yù)測其嚴重程度的辦法一直是圍產(chǎn)醫(yī)學研究的重點和熱點。對于妊娠期高血壓疾病，目前公認的病因?qū)W說有:血管內(nèi)皮受損學說、免疫學說、滋養(yǎng)細胞異常入侵學說、氧化應(yīng)激學說、遺傳學說以及一元化學說等。盡管目前的研究在血管內(nèi)皮受損、免疫以及分子遺傳方面發(fā)現(xiàn)了一些潛在的生物標志物，如血清血管內(nèi)皮生長因子、腫瘤壞死因子α、一氧化氮、內(nèi)皮素、胎盤蛋白13、血漿血管性假血友病因子、胎盤整合素等，這些物質(zhì)被實驗證實參與了疾病發(fā)生、發(fā)展的過程，其含量存

3、在一定的變化，可以可用來反映子癇前期病情的嚴重程度，有希望成為該疾病的檢測指標。但是，由于導致該疾病的多種病因并不獨立而是彼此緊密聯(lián)系，始終沒能找到特異性的檢測指標和方法作為該疾病的早期篩查和疾病嚴重程度預(yù)測的辦法，有效的應(yīng)用于臨床。
　　 傳統(tǒng)蛋白質(zhì)功能研究大多是在已有的工作基礎(chǔ)上對某幾個蛋白質(zhì)進行分析，從理論上推導出對疾病發(fā)生發(fā)展可能具有重要意義的蛋白質(zhì)，繼而進行深入細致的功能研究。而這種“假設(shè)驅(qū)動”的研究策略往往存在片面性

4、、主觀性和低效率等缺點。隨著人類基因組計劃（HGP）的提前完成，蛋白質(zhì)組學的理論系統(tǒng)和技術(shù)方法已經(jīng)成為后基因組時代的主旋律。由于蛋白質(zhì)組學研究具有大規(guī)模、高通量、高靈敏度的特點，因此可以有效地、客觀地分析細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)整體。差異蛋白質(zhì)組學能通過比較樣本間蛋白質(zhì)表達水平的變化，尋找差異分子，用以解決各種各樣的生物學問題，在臨床上可以從整體上研究與疾病相關(guān)的差異蛋白質(zhì)組，尋找疾病的標記蛋白，已廣泛應(yīng)用于疾病的早期篩查和診斷。目前已涌現(xiàn)出許多

5、新的差異蛋白質(zhì)組分析方法，其中熒光差異凝膠電泳(DIGE)技術(shù)由于繼承了二維凝膠電泳(2-DE)的高分辨率，同時又具備高重現(xiàn)性、高靈敏度、高通量和高動態(tài)范圍等優(yōu)勢，使得DIGE日益受到關(guān)注，成為最受歡迎的定量蛋白質(zhì)組學研究手段之一。DIGE是一種在2D電泳之前進行熒光染料標記蛋白樣品的方法，通過對不同的蛋白樣品用不同的熒光染料進行標記，在同一塊雙向凝膠中可同時分離多至三種不同的蛋白樣品，并且每塊膠上均引入了內(nèi)標，內(nèi)標的利用可以進一步增加

6、可信度，確保結(jié)果能反映出真實的生物學差異，避免了系統(tǒng)誤差對實驗結(jié)果的影響，從而能夠?qū)悠烽g蛋白質(zhì)豐度差異進行精確分析。
　　 聯(lián)合應(yīng)用DIGE分離蛋白和質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白為差異蛋白質(zhì)組學研究提供了最為有效的技術(shù)平臺，實現(xiàn)了快速、高效、高通量檢測，目前該種技術(shù)在惡性腫瘤（鼻咽癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌）、自身免疫性疾病、感染性疾病等的早期診斷上顯示了不可估量的價值，其診斷的敏感性和特異性均可達90％以上。近年來一些學者

7、已將其用于產(chǎn)科領(lǐng)域研究，通過對孕婦附屬物及孕婦體液，如胎盤、羊水、血液、腦脊液、尿液等的差異蛋白質(zhì)譜的分析，有望闡明妊娠及其嚴重并發(fā)癥的相關(guān)的分子生物學基礎(chǔ)，通過比較正常妊娠婦女和患有產(chǎn)科合并癥的孕婦的胎盤組織及體液的差異蛋白質(zhì)譜，能發(fā)現(xiàn)一些潛在的特異性的分子生物學標志蛋白。
　　 尿液是血液經(jīng)腎小球濾過、腎小管和集合管重吸收、排泄及分泌產(chǎn)生的終末代謝產(chǎn)物，其組成、數(shù)量與性狀的變化攜帶有泌尿系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的各種信息，也

8、可反映機體整體代謝狀態(tài)，與血清等其他體液樣本相比，其獲取無創(chuàng)、收集便利，并且蛋白組成相對簡單、易于分析。國內(nèi)外學者目前熱衷于對生理和疾病狀態(tài)下的尿液進行蛋白質(zhì)組學分析，并已經(jīng)獲得了正常尿液標準蛋白圖譜，同時也著手開始研究疾病狀態(tài)下尿蛋白的變化。
　　 因此本研究擬選用正常妊娠女性和妊娠期高血壓疾病孕婦的尿液作為研究對象，利用基于DIGE-基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時間/飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)-生物信息學(b

9、ioinformatics)的差異蛋白質(zhì)組學技術(shù)平臺，來尋找并分析在妊娠期高血壓疾病發(fā)生發(fā)展中的尿液中的差異蛋白質(zhì)，然后采用臨床上經(jīng)典且易操作的酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測妊娠期高血壓疾病孕婦和正常妊娠女性尿液中特定差異蛋白質(zhì)的含量進行驗證實驗，確定特異性的蛋白標記物，從而早期篩查妊娠期高血壓疾病的高危人群，對其進行產(chǎn)前監(jiān)控及早期預(yù)防，早期診斷該疾病同時預(yù)測其嚴重程度，及時阻止該病的發(fā)生、發(fā)展，減少子癇、HELLP綜合征等嚴重并

10、發(fā)癥的發(fā)生，降低孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡率。
　　 第一部分妊娠期高血壓疾病尿液差異蛋白質(zhì)組的鑒定與生物信息學分析
　　 [目的]妊娠期高血壓疾病病因和發(fā)病機制不明確，各種不同病因之間相互聯(lián)系和影響導致目前仍無特異性的檢測指標和方法早期篩查、診斷該疾病并預(yù)測疾病嚴重程度。本研究利用差異蛋白質(zhì)組學技術(shù)平臺，尋找妊娠期高血壓疾病發(fā)生發(fā)展過程中的特異性蛋白標記物。
　　 [方法]選擇符合入選標準的5例妊娠期高血壓患者、5例輕

11、度子癇前期患者、5例重度子癇前期患者和5例正常妊娠女性，收集其尿液標本，進行雙向差異凝膠電泳分析，然后利用全自動切膠儀Spot picker挖取差異蛋白膠粒，并進行樣品膠內(nèi)酶解，再使用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀進行分析，尋找出正常妊娠女性和妊娠期高血壓疾病孕婦尿液中的差異蛋白質(zhì)，最后通過Mascot軟件檢索SwissProt數(shù)據(jù)庫對蛋白進行鑒定。
　　 [結(jié)果]根據(jù)DIGE的差異圖譜并結(jié)合Decyder差異分析軟件進行差異

12、蛋白點分析，妊娠期高血壓組和正常妊娠組相比較，共找到了44個差異蛋白點，其中上調(diào)的有22個，下調(diào)的有22個;輕度子癇前期組和妊娠期高血壓組相比較，共找到了50個差異蛋白點，其中上調(diào)的有15個，下調(diào)的有35個;重度子癇前期組和輕度子癇前期組相比較，共找到了45個差異蛋白點，其中上調(diào)的有9個，下調(diào)的有36個。有些差異蛋白點在幾組之間均有變化，共分析出65個差異蛋白質(zhì)點。經(jīng)質(zhì)譜分析后共鑒定出包括前列腺素-H2D-異構(gòu)酶(prostagland

13、in-H2D-isomerase，又稱為Lipocalin型前列腺素D合成酶(L-PGDS))、基底膜特異的硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白(basementmembrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein，又稱為Perlecan)、激肽原和妊娠特異性β-1-糖蛋白11等的30種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)相互作用分析顯示這30種蛋白質(zhì)中其中19種存在直接或間接的相互作用。
　　

14、 [結(jié)論]利用基于DIGE-MALDI-TOF/TOF-生物信息學的差異蛋白質(zhì)組學技術(shù)平臺，發(fā)現(xiàn)妊娠期高血壓疾病和正常妊娠女性尿液中存在差異表達的蛋白質(zhì)，且這些蛋白質(zhì)之間存在相互作用，這些差異蛋白質(zhì)可能與該疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有望成為其特異性蛋白標記物。
　　 第二部分妊娠期高血壓疾病相關(guān)差異蛋白質(zhì)的初步定量研究
　　 第一章L-PGDS在妊娠期高血壓疾病孕婦尿液中的含量變化
　　 [目的]蛋白組學分析發(fā)

15、現(xiàn)L-PGDS在妊娠期高血壓疾病尿液中存在差異表達。L-PGDS可催化前列腺素(PG) H2轉(zhuǎn)變?yōu)镻GD2，后者具有抑制血小板凝集、誘導血管舒張等功能。本研究擬通過比較正常妊娠組、妊娠期高血壓組、輕度子癇前期組和重度子癇前期組尿液中L-PGDS濃度來證實其是否存在變化，可用來診斷妊娠期高血壓疾病并預(yù)測該疾病的嚴重程度。
　　 [方法]確診時收集正常妊娠女性、妊娠期高血壓、輕度子癇前期和重度子癇前期患者無菌尿液10ml，每組各20

16、例，應(yīng)用ELISA方法檢測尿液標本中L-PGDS的濃度，然后進行對比分析。
　　 [結(jié)果]經(jīng)Levene檢驗顯示四組方差齊性，選用One-Way ANOVA進行方差分析，結(jié)果顯示四組尿液中L-PGDS濃度存在顯著差異，進一步使用LSD檢驗方法進行兩兩比較發(fā)現(xiàn)妊娠期高血壓組患者尿液中L-PGDS濃度（1.32±0.16μg/mL）和正常妊娠組（1.26±0.25μg/mL）無顯著差異;而輕度子癇前期組（0.94±0.23μg/mL

17、）和重度子癇前期組（0.78±0.23μg/mL）患者尿液中L-PGDS濃度則顯著低于正常妊娠組。相對于妊娠期高血壓組，輕度子癇前期組和重度子癇前期組尿液中L-PGDS濃度均顯著降低。重度子癇前期組患者尿液L-PGDS濃度顯著低于輕度子癇前期組(P=0.023)。由此可見，相對于正常妊娠女性，子癇前期時患者血漿中L-PGDS經(jīng)腎小球濾過減少導致尿液中含量降低，并且隨著疾病的嚴重程度其濃度逐漸遞減。而對于妊娠期高血壓患者，其尿液中L-PG

18、DS濃度沒有出現(xiàn)下降，可能提示此時患者腎臟功能正處于代償狀態(tài)。
　　 [結(jié)論]尿液中L-PGDS濃度在妊娠期高血壓疾病不同分類中存在差異，可以很好區(qū)別妊娠期高血壓和子癇前期，并反映子癇前期的嚴重程度，可作為尿液中一種較好的蛋白標記物來判斷該疾病的發(fā)生發(fā)展情況。
　　 第二章Perlecan在妊娠期高血壓疾病孕婦尿液中的含量變化
　　 [目的]蛋白組學分析發(fā)現(xiàn)Perlecan在妊娠期高血壓疾病尿液中存在差異表達。P

19、erlecan作為腎小球基底膜的重要組成成分，主要參與其負電荷屏障的維持。本研究擬通過比較正常妊娠組、妊娠期高血壓組、輕度子癇前期組和重度子癇前期組尿液中Perlecan濃度來證實其是否存在差異，可用來診斷妊娠期高血壓疾病并預(yù)測該疾病的嚴重程度。
　　 [方法]確診時收集正常妊娠、妊娠期高血壓、輕度子癇前期和重度子癇前期患者無菌尿液10ml，每組各20例，應(yīng)用ELISA方法檢測尿液標本中Perlecan的濃度，然后進行對比分析。

20、
　　 [結(jié)果]經(jīng)Levene檢驗顯示四組方差不齊，選用類似方差分析Welch檢驗進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示四組尿液中Perlecan濃度存在顯著差異，進一步使用DunnettT3檢驗方法進行兩兩比較發(fā)現(xiàn)妊娠期高血壓組患者尿液中Perlecan濃度(12.73±3.71nmol/L)高于正常妊娠組(9.99±1.85nmol/L)，存在顯著差異;輕度子癇前期組(8.02±1.66nmol/L)和重度子癇前期組（6.63±1.39nm

21、ol/L）患者尿液中Perlecan濃度則顯著低于正常妊娠組。相對于妊娠期高血壓組，輕度子癇前期組和重度子癇前期組尿液中Perlecan濃度均顯著降低。重度子癇前期組患者尿液Perlecan濃度顯著低于輕度子癇前期組。由此可見，相對于正常妊娠女性，子癇前期時患者腎小球基底膜上Perlecan分子結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化導致尿液中含量降低，并且隨著疾病的嚴重程度其濃度逐漸遞減，此時大量蛋白從腎小球漏出形成蛋白尿。而對于妊娠期高血壓患者，其尿液中