基于“微者逆之,甚者從之”理論探討“回陽方”干預(yù)急性肝衰竭大鼠陰陽離決的抗炎免疫分子機制.pdf

1、目的：建立由D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的急性肝衰竭大鼠模型，觀察“回陽方”對急性肝衰竭大鼠肝功能、病理學(xué)及生存期的影響，并以此為基礎(chǔ)進一步探討其抗肝衰竭的抗炎免疫分子機制，為肝衰竭的防治開拓新思路并提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：通過單次腹腔注射不同劑量的D-氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）確定構(gòu)建急性肝衰竭(ALF)大鼠模型的最佳劑量。70只體重為180±20g的雌性SD大鼠以是否接受造模和不同的藥物干預(yù)隨機分為四組

2、：空白組、模型組、復(fù)方甘草酸苷組（美能組）和回陽方組（實驗組）。其中空白組含10只大鼠，不接受 D-GalN造模，以等劑量的生理鹽水代替，腹腔注射前3天給予蒸餾水10ml/kg/d灌胃。模型組含20只大鼠，接受D-GalN造模，造模前3天給予蒸餾水10ml/kg/d灌胃。美能組含20只大鼠，接受D-GalN造模，造模前3天給予成人等效臨床劑量的美能15.6mg/kg/d灌胃。實驗組含20只大鼠，接受 D-GalN造模，造模前3天給予成人

3、等效臨床劑量的“回陽方”18.8g/kg/d灌胃。灌胃持續(xù)5天。造模后36 h經(jīng)大鼠股動脈取血4ml置于干燥管中,另取2ml置于枸櫞酸鈉抗凝管中,均在3000轉(zhuǎn)/分鐘的速度下進行離心10分鐘，置血清于-20℃保存以備檢測ALT、AST、TBIL、ALB、CHE及PT水平。取血后斷頸處死大鼠，并取肝組織，置于10％中性福爾馬林液固定后放至-70攝氏度的冰箱儲存，用于：常規(guī) HE染色肝組織病理學(xué)觀察，并記錄病理評分；實時熒光定量 PT-PC

4、R檢測TLR4、NF-κB、HMGB1和caspase-3的表達水平；免疫組織化學(xué)染色檢測 PCNA表達水平。另有55只體重為180±20g的雌性SD大鼠以用樣的造模及給藥方案隨機分為空白組、模型組、美能組和實驗組，各組大鼠的只數(shù)分別為10、15、15、15只。本組用于觀察造模后大鼠的一般情況、行為學(xué)改變和生存期，并描繪生存曲線。觀察時間點為腹腔注射伊始到注射后96小時。
　　結(jié)果：⑴預(yù)實驗確定誘導(dǎo)ALF的最佳造模劑量為1.4g/

5、kg。⑵一般情況：腹腔注射D-GalN后，模型組大鼠逐漸出現(xiàn)食欲下降、行為遲鈍及對刺激的靈敏度下降等一系列行為學(xué)改變，同時誘發(fā)尿失禁，尿黃，精神不振，嗜睡，煩躁，抽搐，出血等嚴重癥狀。與模型組相比，經(jīng)“回陽方”治療后，實驗組大鼠上述癥狀均明顯減輕，且更重要的是，在治療過程中沒有發(fā)現(xiàn)與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)。⑶生存期：腹腔注射后96小時，模型組、美能組、實驗組的生存率分別為33.3%、46.7%、66.7%，三組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.0

6、5）；經(jīng)Kaplan-Meier分析，估計模型組、美能組、實驗組的平均生存時間分別為64.6、71.9、83.9小時,同時經(jīng)過log-rank檢驗提示，實驗組與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；實驗組與美能組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；而美能組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。⑷療效指標：肝功能：腹腔注射后36h，與空白組相比，模型組大鼠ALT、AST、TBIL水平顯著升高，而ALB、CHE水平則顯

7、著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組和美能組相比，實驗組ALT、AST、TBIL水平顯著降低，而ALB、CHE水平則顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；凝血功能：腹腔注射后36h，與空白組相比，模型組大鼠PT顯著延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組和美能組相比，實驗組的PT顯著縮短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；③肝組織病理評分：腹腔注射后36h，各組大鼠肝組織均有不同程度的病理損害，其中模型

8、組最嚴重，經(jīng)美能或回陽方治療后，病理損傷均有減輕，且以回陽方組最佳。與模型組和美能組相比，實驗組病理損害評分明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。⑸機制指標：腹腔注射后36h，經(jīng)RT-PCR檢驗，與空白組相比，模型組大鼠TLR4、NF-κB、HMGB1、caspase-3水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組和美能組相比，實驗組TLR4、NF-κB、HMGB1、caspase-3水平顯著降低，差異均勻統(tǒng)計學(xué)意

9、義（P<0.05）；腹腔注射后36h，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色檢測，與空白組相比，各組大鼠肝組織PCNA表達有所增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其中以實驗組為最佳，與模型組和美能組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：①本實驗中，顯著升高的ALT、AST、TBIL水平，明顯延長的PT，顯著降低的ALT、CHE水平，明顯增加的肝組織病理評分以及快速的死亡率均表明急性肝衰竭大鼠模型造模成功，且D-GalN最佳劑量為