基于濁毒理論的肝復(fù)健方抗大鼠肝纖維化作用及機(jī)制研究.pdf

1、肝纖維化(Hepaticfibrosis,HF)是指各種致病因素所引起肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)的合成大于降解,致使ECM在肝臟內(nèi)過(guò)度沉積,它是大多數(shù)慢性肝病所共有的病理特征,也是慢性肝炎進(jìn)一步向肝硬化、肝癌發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。肝纖維化是可被逆轉(zhuǎn)的階段,如能阻斷和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生,就可阻止嚴(yán)重后果的發(fā)生。
　　 肝纖維化的形成是一個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)、多階段的復(fù)雜過(guò)程,其形成不是靜止的,而是不斷

2、變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程。各種細(xì)胞因子形成的復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),不斷影響著肝纖維化的形成和轉(zhuǎn)歸。從細(xì)胞因子及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)角度研究藥物的作用機(jī)制,將不斷深化肝纖維化的治療學(xué)研究。瘦素(leptin)與肝纖維化的形成之間有著密切的關(guān)系,與瘦素受體結(jié)合后,激活相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。
　　 目前臨床上仍然缺乏確切特效的抗纖維化藥物與方法。中醫(yī)藥具有多層次、多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn),在治療肝纖維化方面取得了顯著的成果。李佃貴教

3、授提出濁毒內(nèi)蘊(yùn),肝絡(luò)瘀滯是肝纖維化的主要病機(jī)之一,并從濁毒論治肝纖維化,在此指導(dǎo)下確立肝復(fù)健方,取得顯著療效。既往臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明,肝復(fù)健方具有明顯的阻斷病毒性乙型肝炎慢性化、減輕肝纖維化及保護(hù)肝功能的作用。本課題繼續(xù)在腹腔注射豬血清復(fù)制免疫性肝纖維化模型的基礎(chǔ)上,觀察肝復(fù)健方對(duì)大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)、肝纖四項(xiàng)、MMP-1、瘦素(leptin)及其受體(OB-Rb)、JAK2、STAT3的表達(dá)情況,探討其對(duì)瘦素調(diào)控肝纖維化大鼠JAK2/

4、STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響,旨在對(duì)本方抗HF的藥效和可能的作用機(jī)制進(jìn)一步的研究,為肝纖維化的預(yù)防與治療提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)分為以下五部分:
　　 第一部分:濁毒理論與肝纖維化
　　 目的:探討濁毒理論與肝纖維化的關(guān)系,明確其在肝纖維化中的重要地位,提出肝纖維化治療的新觀點(diǎn)與新方法。
　　 方法:通過(guò)溫習(xí)、回顧、整理中醫(yī)文獻(xiàn),并結(jié)合臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),提出濁毒理論,提出肝纖維化的新病機(jī),系統(tǒng)總結(jié)了肝纖維化濁毒證證治規(guī)律

5、。
　　 結(jié)果:提出了濁毒理論,明確了濁毒的概念、臨床表現(xiàn)及致病特點(diǎn)。探討了濁毒與肝纖維化的關(guān)系,總結(jié)出了肝纖維化濁毒證證治規(guī)律,從臨床上驗(yàn)證了從濁毒治療肝纖維化的可行性。
　　 結(jié)論:濁毒理論是中醫(yī)學(xué)術(shù)體系的新的組成部分,是研究濁毒致病的病因、病機(jī)、診斷、治療等理法方藥的學(xué)科。濁毒與肝纖維化關(guān)系密切,是其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　 第二部分:肝復(fù)健方對(duì)肝纖維化大鼠病理形態(tài)學(xué)和血清標(biāo)志物的影響
　　 目的

6、:觀察肝復(fù)健方對(duì)豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠病理形態(tài)學(xué)及血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原含量的影響,探討其抗纖維化的作用機(jī)制。
　　 方法:清潔級(jí)SD大鼠60只,雄性,體重200±20g。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Normalgroup)、模型組(Modelgroup)、秋水仙堿組(Colchicine)、肝復(fù)健方低劑量組(GFJLgroup)、肝復(fù)健方中劑量組(GFJMgroup)、肝復(fù)健方高劑量組(GFJHgroup)

7、六組,每組10只。每周二、周五上午8點(diǎn),采用無(wú)菌未滅活的豬血清腹腔注射進(jìn)行造模,連續(xù)8周。造模成功后正常對(duì)照組與模型組給予生理鹽水(10ml/kg),日1次灌胃。GFJL組給予含生藥1.4g/ml水煎劑灌胃;GFJM組給予含生藥2.8g/ml水煎劑灌胃;GFJH組給予含生藥4.2g/ml水煎劑灌胃(灌胃液體量為10ml/kg,1次/d);秋水仙堿組給予0.154mg/kg·d灌胃,均至12周末。實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠的一般情況。12周末采用腹

8、主動(dòng)脈取血,分離血清,用放射免疫分析法測(cè)定各組大鼠血清中HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平。留取大鼠肝組織,采用蘇木精-伊紅染色(HE染色)和膠原纖維特殊染色法(Masson染色)觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)改變。
　　 結(jié)果:
　　 1.一般情況
　　 正常對(duì)照組一般情況良好,精神狀態(tài)好,活潑好動(dòng),大鼠食欲佳,進(jìn)食量正常,皮毛光滑,體重逐漸增加。模型組大鼠精神萎靡、不喜活動(dòng),進(jìn)食較正常組少,皮毛雜亂、黯淡無(wú)光澤、尿黃,個(gè)別大

9、鼠鼻有出血,體重增長(zhǎng)變慢。秋水仙堿及中藥治療各組大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)、進(jìn)食量尚可,被毛光澤,體重有所增加,無(wú)特殊異常狀態(tài)出現(xiàn)。
　　 2.肝臟大體觀察
　　 正常組大鼠肝臟質(zhì)地較軟,表面光滑,略呈深紅色,有光澤,無(wú)任何斑點(diǎn)、突起,邊緣銳利。模型組大鼠肝臟質(zhì)地硬,表面欠光滑,部分標(biāo)本表面粗糙,凹凸不平,顏色暗紅,邊緣鈍。秋水仙堿及中藥治療組大鼠肝臟質(zhì)較脆,表面較光滑,顏色基本正常,基本無(wú)斑點(diǎn)、突起等。
　　 3.肝復(fù)

10、健方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織病理的影響
　　 正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整,肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列,無(wú)變性壞死,未見(jiàn)纖維組織增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,肝細(xì)胞索排列紊亂,肝細(xì)胞變性,部分肝細(xì)胞壞死,伴有中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),纖維組織大量增生,個(gè)別動(dòng)物可見(jiàn)假小葉形成。秋水仙堿組與中藥治療各組肝臟損傷程度均較模型組輕,肝小葉結(jié)構(gòu)破壞減輕,肝臟膠原纖維增生減輕,肝細(xì)胞水腫好轉(zhuǎn),變性情況明顯改善,炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少。肝復(fù)健

11、方高劑量組肝臟結(jié)構(gòu)改善最為明顯。
　　 4.肝復(fù)健方對(duì)肝纖維化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ的影響
　　 與正常對(duì)照組相比,模型組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型對(duì)照組相比,12周末各藥物干預(yù)組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平下降(P＜0.05)。肝復(fù)健方高劑量組血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平顯著性降低,優(yōu)于秋水仙堿組、中劑量組及低劑量組(P＜0.05);秋水仙堿

12、組、肝復(fù)健中劑量組之間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);秋水仙堿組與肝復(fù)健方低劑量組比較,血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:肝復(fù)健方能夠改善大鼠的一般狀況,顯著降低大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型膠原含量,促進(jìn)ECM的降解,抑制纖維組織增生,改善肝纖維化大鼠的病理組織結(jié)構(gòu),恢復(fù)肝細(xì)胞損傷,達(dá)到抗肝纖維化的作用。
　　 第三部分:肝復(fù)健方對(duì)肝纖維化大鼠疫素及瘦素受體

13、表達(dá)的影響
　　 目的:觀察肝復(fù)健方對(duì)血清瘦素、肝組織瘦素及瘦素受體的影響,進(jìn)一步明確瘦素在肝纖維化形成過(guò)程中的生物學(xué)效應(yīng)以及化濁解毒法抗肝纖維化的深層作用機(jī)制。
　　 方法:放射免疫分析法檢測(cè)血清瘦素(Leptin)水平,逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)肝組織瘦素(leptin)及瘦素受體(OB-Rb)的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.肝復(fù)健方對(duì)大鼠血清Leptin水平的影響
　　

14、與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組、各藥物組血清瘦素水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型對(duì)照組相比,秋水仙堿組和肝復(fù)健方各劑量組血清瘦素水平明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各藥物治療組比較,肝復(fù)健方高劑量組血清瘦素水平顯著性降低,優(yōu)于秋水仙堿組、中劑量組及低劑量組(P＜0.05),秋水仙堿組與中劑量組比較,無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。秋水仙堿組與低劑量組比較,血清瘦素水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

15、
　　 2.肝復(fù)健方對(duì)大鼠肝組織Leptin、OB-RbmRNA表達(dá)的影響
　　 與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組、秋水仙堿組和肝復(fù)健方各劑量組Leptin、OB-RbmRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型對(duì)照組相比,秋水仙堿組和肝復(fù)健方各劑量組Leptin、OB-RbmRNA表達(dá)明顯減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各藥物治療組比較,肝復(fù)健方高劑量組Leptin、OB-RbmRNA表達(dá)顯著性

16、降低,優(yōu)于秋水仙堿組、中劑量組及低劑量組(P＜0.05),秋水仙堿組與中劑量組比較Leptin、OB-RbmRNA的表達(dá)有下降趨勢(shì),但均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。秋水仙堿組與低劑量組比較,Leptin、OB-RbmRNA的表達(dá)減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:瘦素是內(nèi)生濁毒的物質(zhì)基礎(chǔ)之一,肝復(fù)健方能夠有效降低肝纖維化模型大鼠瘦素及瘦素受體的表達(dá),減少兩者的結(jié)合,進(jìn)而抑制下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而達(dá)到抗肝纖維化

17、的作用。
　　 第四部分:肝復(fù)健方對(duì)大鼠肝組織MMP-1表達(dá)的影響
　　 目的:觀察肝復(fù)健方對(duì)HF大鼠肝臟MMP-1表達(dá)的影響,從分子水平探討肝復(fù)健方抗肝纖維化的深層作用機(jī)理。
　　 方法:逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)肝組織MMP-1的表達(dá)。
　　 結(jié)果:與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組、秋水仙堿組和肝復(fù)健方各劑量組MMP-1mRNA的表達(dá)均明顯減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型對(duì)

18、照組相比,秋水仙堿組和肝復(fù)健方各劑量組MMP-1mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各藥物治療組比較,肝復(fù)健方高劑量組MMP-1mRNA的表達(dá)顯著性增強(qiáng),優(yōu)于秋水仙堿組、中劑量組及低劑量組(P＜0.05),秋水仙堿組與中劑量組比較MMP-1mRNA的表達(dá)有增強(qiáng)趨勢(shì),但均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。秋水仙堿組與低劑量組比較,MMP-1mRNA的表達(dá)增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:肝復(fù)健方

19、可以顯著提高M(jìn)MP-1mRNA的表達(dá)水平,通過(guò)抑制HSC合成和分泌瘦素,促進(jìn)MMP-1的表達(dá),從而使細(xì)胞外基質(zhì)降解,阻礙肝纖維化進(jìn)程。
　　 第五部分:肝復(fù)健方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　 目的:觀察肝復(fù)健方對(duì)HF大鼠肝臟JAK2、STAT3蛋白表達(dá)的影響,以進(jìn)一步探討肝復(fù)健方抗肝纖維化的深層作用機(jī)理,為臨床防治肝纖維化提供理論依據(jù)
　　 方法:Westernblot檢測(cè)HF大

20、鼠肝組織JAK2、STAT3的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.肝復(fù)健方對(duì)大鼠肝組織JAK2蛋白表達(dá)的影響
　　 (1)所有實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織中JAK2的表達(dá)量均高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。(2)肝復(fù)健方各劑量組及秋水仙堿組與模型組相比JAK2的蛋白表達(dá)量顯著性降低(P＜0.05)。(3)肝復(fù)健方中劑量組與秋水仙堿組相比JAK2蛋白表達(dá)量均無(wú)顯著性差異(P＞0.05);秋水仙堿組與肝復(fù)健方低劑量組相比JAK2蛋白

21、的表達(dá)量有顯著性降低(P＜0.05),肝復(fù)健方高劑量組與秋水仙堿組相比,JAK2蛋白的表達(dá)量有顯著性降低(P＜0.05)。(4)肝復(fù)健方藥不同劑量組之間比較,高劑量組JAK2蛋白的表達(dá)量?jī)?yōu)于中劑量組,中劑量組優(yōu)于低劑量組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.肝復(fù)健方對(duì)大鼠肝組織STAT3蛋白表達(dá)的影響
　　 (1)所有實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織中STAT3的表達(dá)量均高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。(2)肝復(fù)健方各劑量組及

22、秋水仙堿組與模型組相比STAT3的蛋白表達(dá)量有顯著性降低(P＜0.05)。(3)肝復(fù)健方中劑量組與秋水仙堿組相比STAT3蛋白表達(dá)量均無(wú)顯著性差異(P＞0.05);秋水仙堿組與肝復(fù)健方低劑量組相比STAT3蛋白的表達(dá)量有顯著性降低(P＜0.05),肝復(fù)健方高劑量組與秋水仙堿組相比,STAT3蛋白的表達(dá)量有顯著性降低(P＜0.05)。(4)肝復(fù)健方藥不同劑量組之間比較,高劑量組STAT3蛋白的表達(dá)量?jī)?yōu)于中劑量組,中劑量組優(yōu)于低劑量組,差異