小鼠急性肝衰竭模型的構(gòu)建與機制.pdf

1、背景和目的:急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是一個危及生命的嚴(yán)重病理生理狀態(tài)。它可導(dǎo)致肝臟合成、排泄、解毒、生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙或失代償，出現(xiàn)凝血功能障礙、黃疸以及肝性腦病等主要表現(xiàn)的臨床綜合征。因其死亡率極高，嚴(yán)重ALF的治療是當(dāng)今臨床醫(yī)學(xué)中最具有挑戰(zhàn)的課題之一。為了有效地治療ALF，制備與ALF發(fā)病經(jīng)過相同、臨床表現(xiàn)類似并可復(fù)制的動物模型是解決此難題的第一步，而了解各種ALF動物模型的構(gòu)建機制就顯得

2、尤為重要。本課題以氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)、四氯化碳(tetrachloromethane，CCl4)、刀豆蛋白A（concanavalin-A，ConA）三種常用造模藥物誘導(dǎo)小鼠ALF，并探討了其誘導(dǎo)ALF的發(fā)病機制，為ALF動物模型的合理應(yīng)用提供參考，同時為ALF的臨床治療提供干預(yù)依據(jù)。
　　方法:本研究選用MLKL+/+及MLKL-/-兩種基因型，6-8周雄性C57/B6小鼠。首先按照兩種基因型將小鼠

3、分成兩組，分別用AOM、CCl4以及ConA三種藥物構(gòu)建ALF模型，觀察小鼠一般情況及生存率，判斷該模型是否依賴于混合系激酶結(jié)構(gòu)域樣（Mixed Lineage Kinase Domain-like，MLKL）基因。再將兩種基因型小鼠分成半胱天冬酶(cysteine containing aspartate specific protease，Caspase)家族抑制劑(Z-VAD-FMK，ZVAD)組，Caspase1抑制劑(Ac-Y

4、VAD-CMK，CMK)組以及二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)組，在注射AOM、CCl4以及ConA之前提前一小時分別給予小鼠腹腔注射ZVAD、CMK以及DMSO。造模完成后通過測量血清生化指標(biāo)如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase，AST)以及膽堿酯酶(cholinesterase，CHE)，并

5、以免疫組化病理切片以及蛋白免疫印跡(westernblotting)等實驗方法檢測相關(guān)指標(biāo)，判斷AOM、CCl4以及ConA誘導(dǎo)的ALF模型分別是通過細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死以及細(xì)胞焦亡中的哪條途徑對肝細(xì)胞造成損傷的。
　　結(jié)果:通過小鼠一般狀況的觀察及生存曲線的統(tǒng)計顯示:在AOM誘導(dǎo)的ALF模型中，MLKL基因型對小鼠一般情況以及生存率無影響;在CCl4誘導(dǎo)的ALF模型中，MLKL+/+組小鼠的生存率低于MLKL-/-組;在ConA誘

6、導(dǎo)的ALF模型中，MLKL+/+及MLKL-/-兩組小鼠生存率無差別。生化指標(biāo)ALT、AST以及CHE的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示:在AOM誘導(dǎo)的ALF模型中，Caspase家族抑制劑ZVAD能夠起保護肝臟作用，而Caspase1抑制劑CMK則不起保護肝臟作用;在CCl4誘導(dǎo)的ALF模型中，全Caspase家族抑制劑ZVAD及Caspase1抑制劑CMK均不起保護肝臟作用;在ConA誘導(dǎo)的ALF模型中，全Caspase家族抑制劑ZVAD及Caspas

7、e1抑制劑CMK均能起保護肝臟作用。病理切片顯示:在AOM誘導(dǎo)的ALF模型中，可見胞漿嗜酸性變及凋亡小體，肝細(xì)胞脂肪樣變，伴淋巴細(xì)胞浸潤;在CCl4誘導(dǎo)的ALF模型中，可見點狀及灶狀壞死灶，淋巴細(xì)胞及吞噬細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞腫脹，發(fā)生脂肪變性;在ConA誘導(dǎo)的ALF模型中，可見點狀壞死灶，同時可見嗜酸性變及伴有大量淋巴細(xì)胞浸潤的炎癥反應(yīng)。Western blotting顯示:AOM誘導(dǎo)的ALF模型中，Caspase8被激活而Caspase1