青少期慢性應(yīng)激大鼠的免疫炎癥改變及四逆散干預(yù)機(jī)制.pdf

1、目的:
　　探討青少期慢性應(yīng)激對(duì)不同性別大鼠行為學(xué)、海馬神經(jīng)元、外周免疫及中樞免疫的影響，及四逆散的干預(yù)機(jī)制。
　　方法:
　　4周齡Wistar大鼠雌雄各半，按體重隨機(jī)分為空白組不接受應(yīng)激，應(yīng)激組接受為期21d的慢性不可預(yù)見性應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)，然后應(yīng)激組再次按體重隨機(jī)分為模型組、四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組，繼續(xù)予以CUMS法應(yīng)激，同時(shí)各

2、給藥組給予相應(yīng)藥物水溶液灌胃，空白組和模型組予生理鹽水灌胃，持續(xù)21d。末次給藥后對(duì)各組大鼠檢測(cè)體重、糖水偏好率、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn);采用蘇木精一伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE染色法）觀察各組大鼠海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)區(qū)神經(jīng)元形態(tài);采用默克密理博多因子檢測(cè)技術(shù)(milliplex map)測(cè)定血漿和海馬促炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosisfactorα，TNF-

3、α)、白介素1β(interleukin1β，IL-1β)、白介素6(interleukin6，IL-6)、干擾素γ（interferonγ，IFNγ）和抗炎性細(xì)胞因子白介素4(interleukin4，IL4)、白介素10（interleukin10，IL-10）的濃度;使用Western-blotting技術(shù)檢測(cè)海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物CD11b及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化特征性標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary aci

4、dic protein，GFAP)，以及海馬核轉(zhuǎn)錄因子κBp65(nuclearfactorκBp65，NF-κ B p65)和磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子κ B p65(Phospho-NF-κ B p65);用免疫組織化學(xué)方法觀察各組大鼠海馬DG區(qū)GFAP表達(dá)分布和NF-κ B p65表達(dá)分布。當(dāng)不同性別同組數(shù)據(jù)資料相近并且組間變化趨勢(shì)相同時(shí)，合并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，否則分別按不同性別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:
　　一、四逆散對(duì)青少期慢性

5、應(yīng)激大鼠行為學(xué)的影響
　?。ㄒ唬┮话銧顟B(tài)接受應(yīng)激前，空白組和應(yīng)激組大鼠都精神狀態(tài)良好，毛發(fā)整潔光亮，活潑好動(dòng)，飲食正常。初次應(yīng)激21d后，應(yīng)激組大鼠表現(xiàn)出精神緊張，飲食量減少，毛發(fā)凌亂、枯黃失澤，灌胃和應(yīng)激時(shí)反應(yīng)劇烈，易驚并出現(xiàn)弓背防御狀態(tài)，易激惹。再次應(yīng)激21d后，模型組大鼠精神萎靡，體型瘦削，毛發(fā)凌亂色暗，易于脫落，時(shí)常蜷伏角落貼籠壁;四逆散低劑量組、四逆散高劑量組和氟西汀組大鼠均表現(xiàn)活躍，鼠毛整潔有光澤?？瞻捉M大鼠各方面狀態(tài)

6、保持良好。
　?。ǘw重雄鼠模型組較空白組體重顯著降低（P＜0.05），模型組與四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組體重比較，均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。雌鼠模型組較空白組體重顯著降低（P＜0.05），模型組與四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組體重比較，均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　?。ㄈ┨撬脤?shí)驗(yàn)各組糖水偏好率比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　?。ㄋ模鐖?chǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M較空白組曠場(chǎng)總路程顯著下降（

7、P＜0.05），四逆散低劑量組和氟西汀組均較模型組曠場(chǎng)總路程顯著升高（P＜0.05），四逆散高劑量組較模型組曠場(chǎng)總路程升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　二、四逆散對(duì)青少期慢性應(yīng)激大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響
　　海馬DG區(qū)HE染色結(jié)果雌雄空白組大鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)元形態(tài)清晰，結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，層次緊密，細(xì)胞核清晰，核仁明顯。雄鼠模型組、四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組分別與空白組比較，無(wú)明顯差異。雌鼠模型

8、組神經(jīng)元數(shù)量減少，排列疏松，細(xì)胞層變薄;雌鼠四逆散低劑量組、四逆散高劑量組和氟西汀組均較MC組改善，排列緊密，細(xì)胞層數(shù)增加。
　　三、四逆散對(duì)青少期慢性應(yīng)激大鼠外周免疫炎癥的影響
　?。ㄒ唬┭獫{TNF-α雄鼠各組血漿TNF-α濃度比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。雌鼠模型組較空白組血漿TNF-α濃度顯著降低（P＜0.05），四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組分別較模型組血漿TNF-α濃度顯著升高(P＜0.05)。

9、　　（二）血漿IL-1β各組大鼠血漿IL-1β濃度比較均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　　（三）血漿IL-6、IFNγ、IL-4和IL-10因表達(dá)水平較低，應(yīng)用此方法基本檢測(cè)不到。
　　四、四逆散對(duì)青少期慢性應(yīng)激大鼠海馬免疫炎癥的影響
　?。ㄒ唬┖ｑRTNF-α雄鼠模型組較空白組海馬TNF-α濃度顯著降低(P＜0.05)，模型組與四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組海馬TNF-α濃度比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。雌

10、鼠各組海馬TNF-α濃度比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　?。ǘ┖ｑRIL-1β雄鼠模型組較空白組海馬IL-1β濃度顯著升高（P＜0.05），四逆散低劑量組、四逆散高劑量組均較模型組海馬IL-1β濃度顯著降低(P＜0.05)，氟西汀組較模型組海馬IL-1β降低，但差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。雌鼠各組海馬IL-1β濃度比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　?。ㄈ┖ｑRIL-6模型組較空白組海馬IL-6濃度顯著升高(P＜0.0

11、5)，四逆散低劑量組、四逆散高劑量組均較模型組海馬IL-6濃度顯著降低（P＜0.05），氟西汀組較模型組海馬IL6濃度降低，但差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。
　　（四）海馬IFNγ模型組較空白組海馬IFNγ濃度顯著升高（P＜0.05），四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組均較模型組海馬IFNγ濃度顯著降低(P＜0.05)。
　?。ㄎ澹┖ｑRIL-4模型組較空白組海馬IL-4濃度顯著降低（P＜0.05），四逆散低劑量組較模型

12、組海馬IL-4濃度顯著升高（P＜0.05），四逆散高劑量組、氟西汀組均較模型組海馬IL-4濃度升高，但差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。
　　（六）海馬IL-10雄鼠模型組較空白組海馬IL-10濃度顯著升高（P＜0.05），四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組均較模型組海馬IL-10濃度顯著降低(P＜0.05)。雌鼠各組海馬IL-10濃度比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　?。ㄆ撸┖ｑRCD11b相對(duì)蛋白量雄鼠各組海馬CD11

13、b相對(duì)蛋白量比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。雌鼠模型組較空白組海馬CD11b相對(duì)蛋白量顯著降低（P＜0.05），四逆散低劑量組、四逆散高劑量組均較模型組海馬CD11b相對(duì)蛋白量顯著升高（P＜0.05），氟西汀組與模型組海馬CD11b相對(duì)蛋白量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　?。ò耍?.海馬GFAP相對(duì)蛋白量雄鼠模型組較空白組海馬GFAP相對(duì)蛋白量顯著降低（P＜0.05），模型組與四逆散低劑量組、四逆散高劑量、氟西汀組海馬GFAP相

14、對(duì)蛋白量比較均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。雌鼠模型組較空白組海馬GFAP相對(duì)蛋白量顯著升高（P＜0.05），四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組均較模型組海馬GFAP相對(duì)蛋白量顯著降低（P＜0.05）。
　　2.海馬DG區(qū)GFAP免疫組化結(jié)果鏡下可見GFAP在各組大鼠海馬DG區(qū)均有表達(dá)，主要分布在膠質(zhì)細(xì)胞胞漿及突起，呈棕黃色，星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)呈星形或放射狀。雄鼠空白組大鼠海馬DG區(qū)呈均勻彌漫性染色，有長(zhǎng)短不等而粗壯的突起。模型

15、組大鼠海馬DG區(qū)內(nèi)GFAP表達(dá)下降，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，分布稀疏，突起變短細(xì)、染色變淺。四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組分別與模型組相比較，無(wú)明顯差異。雌鼠空白組大鼠海馬DG區(qū)內(nèi)GFAP免疫陽(yáng)性細(xì)胞胞體較小，突起纖細(xì)。模型組大鼠海馬DG區(qū)內(nèi)GFAP表達(dá)明顯增多，著色密集，陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞突起增粗且分支增多、變長(zhǎng)、深染。四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組海馬DG區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生程度均較模型組明顯改善。
　?。ň牛?.

16、海馬NF-κ B p65相對(duì)蛋白量各組海馬NF-κ B p65相對(duì)蛋白量比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　　2.海馬DG區(qū)NF-κ B p65免疫組化結(jié)果鏡下可見NF-κ B p65在各組大鼠海馬DG區(qū)均有表達(dá)，呈棕黃色著色。雌雄空白組細(xì)胞漿都可見NF-κ Bp65陽(yáng)性表達(dá)，但未見核內(nèi)NF-κ Bp65陽(yáng)性表達(dá)。雌雄模型組同樣有胞漿NF-κ Bp65陽(yáng)性表達(dá)，而且NF-κ Bp65在一部分細(xì)胞核內(nèi)也有陽(yáng)性表達(dá)，可見NF-κ Bp

17、65發(fā)生核移位。與模型組比較，四逆散低劑量組、四逆散高劑量組和氟西汀組NF-κ Bp65同樣主要是在漿表達(dá)，NF-κ Bp65核表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組減少，提示能抑制NF-κ Bp65蛋白核移位。
　?。ㄊ┖ｑRPhospho-NF-κ B p65相對(duì)蛋白量雄鼠各組海馬Phospho-NF-κ B p65相對(duì)蛋白量比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。雌鼠模型組較空白組海馬Phospho-NF-κ B p65相對(duì)蛋白量顯著升高（P＜0.

18、05），四逆散低劑量組、四逆散高劑量組、氟西汀組均較模型組海馬Phospho-NF-κ B p65相對(duì)蛋白量顯著降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　?。ㄒ唬﹩渭兦嗌倨诼詰?yīng)激未引起動(dòng)物抑郁障礙的特征性表現(xiàn)，但可出現(xiàn)一定的自主行為異常，并使雌鼠產(chǎn)生神經(jīng)損傷，形成“生物瘢痕”，留下潛在的長(zhǎng)期的影響。
　?。ǘ﹩渭兦嗌倨诼詰?yīng)激對(duì)中樞免疫的影響比外周免疫顯著。
　?。ㄈ﹩渭兦嗌倨诼詰?yīng)激可引起中樞免疫功能紊亂，包

19、括免疫激活和免疫抑制同時(shí)發(fā)生，如小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)改變，細(xì)胞因子升高或下降，NF-κ B通路激活等，具體表現(xiàn)具有性別差異。應(yīng)激引起的神經(jīng)“生物瘢痕”形成機(jī)制與中樞免疫功能紊亂相關(guān)。
　　（四）四逆散可同時(shí)調(diào)節(jié)單純青少期慢性應(yīng)激引起的免疫激活和免疫抑制，改善免疫紊亂，恢復(fù)免疫平衡，改善神經(jīng)元損傷，提示中藥合劑對(duì)機(jī)體免疫的雙向調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果可為四逆散抗應(yīng)激損傷早期臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　創(chuàng)新點(diǎn):
　?。?/p>

20、一）既往研究慢性心理應(yīng)激影響的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大多針對(duì)成年階段和雄性動(dòng)物。本研究選取青少期階段為研究對(duì)象，對(duì)雌雄動(dòng)物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)青少期慢性應(yīng)激引起的潛在生物學(xué)改變及其性別差異，為精神障礙發(fā)病的預(yù)防和及早干預(yù)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　?。ǘ┘韧鶠閿?shù)不多的青少期應(yīng)激研究主要從神經(jīng)發(fā)生或神經(jīng)內(nèi)分泌的角度探討其中樞病理改變。本研究結(jié)合當(dāng)下研究熱點(diǎn)之一的抑郁炎癥假說(shuō)，從免疫機(jī)制的角度，探討青少期應(yīng)激導(dǎo)致的免疫紊亂，尤其是中樞的免疫失衡，豐富了青少期應(yīng)