慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力障礙及機(jī)制.pdf

1、背景：抑郁是一種常見(jiàn)的神經(jīng)精神疾病，以持久而顯著的心境障礙為主要特征，患者不僅出現(xiàn)情緒紊亂、睡眠障礙、食欲不佳，而且出現(xiàn)包括注意力、學(xué)習(xí)能力、記憶能力、決策能力、執(zhí)行能力等方面的認(rèn)知功能障礙。世界衛(wèi)生組織最新數(shù)據(jù)顯示，全球約有3.5億名患者，其中每年自殺死亡人數(shù)約100萬(wàn)人，已經(jīng)成為世界第四大疾病。此外，抑郁也是重要的神經(jīng)退行性疾病阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，A D)的重要危險(xiǎn)因素之一。
　　抑郁由社會(huì)、

2、生理、心理等多因素相互作用而導(dǎo)致，其中應(yīng)激是抑郁發(fā)病的重要誘因。神經(jīng)影像學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抑郁患者前額葉皮層、杏仁核、海馬等變小，并隨著病程的延長(zhǎng)、抑郁的反復(fù)發(fā)作而更為顯著。尸檢結(jié)果也證實(shí)了抑郁患者海馬、杏仁核、前額葉皮層等腦區(qū)的萎縮。海馬是承擔(dān)空間學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū)，也參與情緒調(diào)節(jié)，其在抑郁發(fā)病過(guò)程中的作用備受關(guān)注。而空間學(xué)習(xí)能顯著增加海馬神經(jīng)元數(shù)量、提高海馬相關(guān)的認(rèn)知能力。抑郁患者下丘腦-垂體-腎上腺軸（Hypothalamic-pitui

3、tary-adrenal axis，H P A a x is)功能紊亂明顯，并伴有血清糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoid，GC)水平升高。GC是機(jī)體重要的一大類應(yīng)激激素，短期內(nèi)升高可以幫助機(jī)體抵御外界刺激，而持續(xù)升高則對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響。海馬富含糖皮質(zhì)激素受體（Glucocorticoid receptor，G R),尸檢發(fā)現(xiàn)抑郁患者海馬中G R的mRNA和蛋白水平均有下降。以上研究提示海馬在抑郁病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，但是抑郁發(fā)

4、病中海馬損傷的機(jī)制仍不清楚，而改善海馬功能能否改善抑郁癥狀等關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題有待深入研究。
　　死亡相關(guān)蛋白激酶1(Death-associated protein kinase1，DAPK1)通過(guò)不同的途徑參與多種腦疾?。ㄈ缒X卒中、A D)中的神經(jīng)元損傷：在腦卒中發(fā)生過(guò)程中，DAPK1激活并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡；在 AD發(fā)生過(guò)程中，DAPK1激活并通過(guò)過(guò)度磷酸化微管相關(guān)蛋白ta u而引起神經(jīng)元退行性變性。胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶/核糖體S6激

5、酶1(Extracellular signal-regulated protein kinase/ribosomal S6 kinase1，ERK/RSK1)是詰抗其損傷的重要信號(hào)分子。DAPK1是否參與抑郁發(fā)病、海馬損傷與DAPK1激活有什么聯(lián)系，這些問(wèn)題至今尚無(wú)研究報(bào)道。
　　目的：研究慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁大鼠是否出現(xiàn)海馬損傷，明確抑郁大鼠海馬損傷的機(jī)制，研究提高抑郁大鼠海馬功能是否能改善抑郁癥狀。
　　方法：選取3月齡雄

6、性SD大鼠，每天隨機(jī)給予某一種刺激，包括束縛2小時(shí)、夜間照明、禁食24小時(shí)、禁水24小時(shí)、高溫（45℃)、冰水游泳（4℃)、夾尾、足底電擊（電流強(qiáng)度0.5 mA)，總共21天。大鼠刺激前后都應(yīng)用曠場(chǎng)、強(qiáng)迫游泳、糖水偏好實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠抑郁程度，并篩選造模成功的抑郁大鼠，然后使用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抑郁大鼠空間學(xué)習(xí)記憶是否受損。使用Bruker小動(dòng)物磁共振成像儀在體檢測(cè)應(yīng)激后大鼠海馬體積。采用Nissl染色檢測(cè)大鼠海馬的神經(jīng)元數(shù)量，Go

7、lgi染色檢測(cè)樹(shù)突棘數(shù)量及分類。使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)應(yīng)激后大鼠血清和海馬皮質(zhì)酮水平。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)糖皮質(zhì)激素受體及相關(guān)分子在海馬的變化。為觀察改善海馬功能對(duì)抑郁行為的影響，我們給予抑郁大鼠7天的水迷宮學(xué)習(xí)，學(xué)習(xí)結(jié)束后進(jìn)行抑郁相關(guān)行為學(xué)及生化、形態(tài)學(xué)檢測(cè)。為研究抑郁大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量減少的機(jī)制，我們通過(guò)免疫印跡檢測(cè)了 GC(10-4 M)處理的N2a細(xì)胞、GC(KT4 M)處理的下調(diào)DAPK1的N2a細(xì)胞、上調(diào)D

8、APK1的N2a細(xì)胞中DAPK1、ERK、RSK1活性及凋亡與自噬相關(guān)分子的變化。
　　結(jié)果：應(yīng)激后的大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)自發(fā)活動(dòng)減弱，在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中靜止時(shí)間明顯延長(zhǎng)，在糖水偏好實(shí)驗(yàn)中糖水消耗百分比降低31.6％,說(shuō)明慢性應(yīng)激能夠誘導(dǎo)大鼠抑郁樣行為。在 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照大鼠第5、6天尋找平臺(tái)的潛伏期分別為13.1秒和12.8秒，而且在第7天的檢測(cè)中首次穿越平臺(tái)區(qū)域的潛伏期為13.2秒、60秒內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)為3.1

9、次。與對(duì)照大鼠相比，抑郁大鼠第5、6天大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期顯著增加，分別為28.4秒和26.2秒；在第7天的檢測(cè)中首次穿越平臺(tái)區(qū)域的潛伏期顯著增加，為23.8秒；60秒內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)顯著減少，為1.7次。在第14天的檢測(cè)中，抑郁大鼠首次穿越平臺(tái)區(qū)域的潛伏期為36.1秒，顯著高于對(duì)照大鼠(12.5秒），并且在60秒內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)為1.6次，顯著低于對(duì)照大鼠（3.9次)。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明抑郁大鼠不僅短期記憶能力受損，長(zhǎng)期記憶能力也同樣受損。

10、
　　長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（Long term potentiation,LTP)是學(xué)習(xí)記憶的功能學(xué)基礎(chǔ)。本研究中通過(guò)刺激內(nèi)嗅區(qū)前穿質(zhì)纖維(Perforant path，PP)并記錄海馬齒狀回(Dentate gyms，D G)即 P P-D G通路的LTP。抑郁大鼠興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potential，ffiP S P)斜率第55-60分鐘降低至對(duì)照組的67.9%,第85-90分

11、鐘降低至對(duì)照組的69.4%，說(shuō)明抑郁大鼠海馬LTP的誘導(dǎo)障礙。磁共振成像檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠海馬體積比對(duì)照組減少18.9%。Nissl染色顯示抑郁大鼠海馬CA1、CA3、D G區(qū)神經(jīng)元數(shù)量比對(duì)照大鼠相應(yīng)區(qū)域分別減少18.8%、21.2%、18.9%。G o lg i染色后顯示抑郁大鼠海馬CA1、CA3、D G區(qū)樹(shù)突棘數(shù)量分別減少31.1%、37.1%、41.6%,蘑菇型樹(shù)突在CA1、CA3、D G區(qū)所占比例分別下降46.7%、48.1%、5

12、2.4%。以上結(jié)果說(shuō)明抑郁大鼠出現(xiàn)了海馬結(jié)構(gòu)與功能障礙。
　　進(jìn)一步通過(guò)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠血清和海馬組織中皮質(zhì)酮水平分別升高169.7%、116.5%；免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠海馬G R水平減少21.9%、其 Ser211位點(diǎn)磷酸化程度（pS211-GR)減少了30.4%。大鼠腦片免疫組織化學(xué)染色顯示了 G R、PS211-GR同樣的變化趨勢(shì)。提示G R活性降低。
　　為研究DAPK1在抑郁大鼠海馬神經(jīng)元損傷中的作用

13、及機(jī)制，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠海馬D A P K1增加193%; E R K總量減少27.3%，E R K磷酸化（p-ERK)水平降低88.2%,提示E R K活性下降;R S K1總量下降37.8%，pS380-RSK下降64.5%,提示R S K1活性下降;含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase3，Caspase3)增加60.8%、Caspase3剪切片

14、段增加193.2%，提不凋亡激活;Beclinl增加52.5%、微管相關(guān)蛋白輕鏈3 II（Microtubule-associated protein light chain3 II，LC3 II)增加45.7%，提示自噬體形成增多。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠海馬CA1、CA3、D G區(qū)DAPK1著色程度變深，海馬CA1、CA3、D G區(qū)DAPK1分別增加143.7%、72.9%、91.5%,并且DAPK1在神經(jīng)元內(nèi)的分布發(fā)生改變，由

15、神經(jīng)元突起轉(zhuǎn)移至神經(jīng)元胞體中。抑郁大鼠海馬C A1、C A3區(qū)E R K分別降低18.7%、28.9%；海馬CA1、C A3區(qū)p-ERK水平分別降低47.6%、38.4%。
　　體外用糖皮質(zhì)激素（104 M)處理N2a細(xì)胞24小時(shí)后，與無(wú)GC處理的細(xì)胞相比，DAPK1增加56.5%、Caspase3總量增加180.3%、Caspase3剪切片段增加119.9%、Beclinl增加192.6%、LC3 II增加50.3%、ERK總量

16、減少40.6%、p-ERK降低68.6%、RSK1總量下降28.2%、pS380-RSK減少68.6%。
　　N2a細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siDAPKl質(zhì)粒48小時(shí)，GC(10-4 M)處理24小時(shí)，與質(zhì)粒載體對(duì)照組比較DAPK1表達(dá)降低70.4%、E R K總量增加46.4%、p-ERK增加134.6%、RSK1總量增加119.0%、pS380-RSK增加49.1%、Caspase3總量減少68.9%、Caspase3剪切片段減少68.6%

17、、Beclinl減少77.5%、L C3總量減少26.4%、LC3 II減少49.3%。
　　與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體的對(duì)照組比較，N2a細(xì)胞中過(guò)表達(dá)DAPK1質(zhì)粒48小時(shí)后,DAPK1表達(dá)增加70.4%、E R K總量減少75.5%、p-ERK減少63.7%、R S K1總量減少59.0%、PS380-RSK減少81.5%。以上研究結(jié)果提示應(yīng)激后糖皮質(zhì)激素水平升高可顯著激活DAPK1、進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡、自噬體增加；同時(shí)，DAPK1激活抑

18、制了ERK和RSK1活性，減少了 ERK和RSK1對(duì)DAPK1誘導(dǎo)凋亡的拮抗作用。
　　為進(jìn)一步證實(shí)海馬在抑郁進(jìn)程中的重要性，我們給予抑郁大鼠7天的水迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練，經(jīng)過(guò)7天空間學(xué)習(xí)的抑郁大鼠在水迷宮中尋找平臺(tái)的潛伏期顯著降低，在曠場(chǎng)試驗(yàn)中5分鐘內(nèi)的穿越的總格子數(shù)（水平得分）為66.2,比學(xué)習(xí)前顯著增加；雙上肢上抬攀爬箱壁次數(shù)（垂直得分）為15.08次，比學(xué)習(xí)前顯著增加；運(yùn)動(dòng)總路程為14.37米，比學(xué)習(xí)前顯著增加。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)

19、過(guò)空間學(xué)習(xí)的抑郁大鼠在水中的靜止時(shí)間由154.3秒縮短為74.8秒，比學(xué)習(xí)前顯著減少。糖水偏好實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過(guò)空間學(xué)習(xí)的抑郁大鼠糖水消耗百分比為75.9%,比學(xué)習(xí)前的46.5%有明顯增加，說(shuō)明其抑郁樣的行為有明顯改善。而未經(jīng)過(guò)空間學(xué)習(xí)的抑郁大鼠的上述行為學(xué)觀察指標(biāo)無(wú)顯著變化。
　　Golgi染色研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)空間學(xué)習(xí)的抑郁大鼠海馬CA1、CA3、D G區(qū)樹(shù)突棘密度分別為4.97/10μm、5.01/10μm、5.12/10μm,比未經(jīng)過(guò)

20、空間學(xué)習(xí)的抑郁大鼠相應(yīng)區(qū)域的樹(shù)突棘密度顯著增加，其中蘑菇型樹(shù)突棘所占的比例也分別增加37.0%、38.6%、43.0%。免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)過(guò)空間學(xué)習(xí)的抑郁大鼠相比，經(jīng)過(guò)空間學(xué)習(xí)的抑郁大鼠海馬DAPK1水平降低81.4%、ERBC增加36.2%、p-ERK增加42.4%、RSK1增加63.6%、p380-RSK增加73.8%、Caspase3降低126.7%、Caspase3剪切片段降低236.3%、Beclin1降低91.6%、L

21、C3 II降低92.4%。
　　以上結(jié)果說(shuō)明空間學(xué)習(xí)能顯著改善抑郁大鼠的抑郁行為；降低DAPK1的激活、提高ERK和RSK1活性是其中的關(guān)鍵機(jī)制。
　　結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁大鼠出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著減低、海馬神經(jīng)元及樹(shù)突棘數(shù)量減少；應(yīng)激后皮質(zhì)酮水平升高、DAPK1激活并誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞增加可能是其中的關(guān)鍵機(jī)制之一；空間學(xué)習(xí)改善抑郁大鼠的抑郁程度，可能與空間學(xué)習(xí)抑制DAPK1激活、增強(qiáng)海馬ERK和RSK1活性密切相