RP2、COL2A1、PAX3、FOXL2基因變異分析及RP2與NYX蛋白質(zhì)相互作用研究.pdf

1、第一部分 RP2、COL2A1、PAX3、FOXL2基因變異分析
　　 許多疾病的發(fā)生與遺傳背景有關(guān)，研究這些疾病的遺傳相關(guān)分子基礎(chǔ)，有助于認識這類疾病的病因和發(fā)病機制并探索防治措施。本研究在課題組已擁有的眼遺傳病資源庫的基礎(chǔ)上，應用DNA序列分析等分子遺傳學技術(shù)，研究視網(wǎng)膜色素變性、中高度近視、Waardenburg綜合征和小瞼裂綜合征的相關(guān)基因，尋找致病突變并分析基因型與表型的關(guān)系，為相關(guān)疾病診斷、預防及分子機制研究奠定基礎(chǔ)

2、。
　　 第1章 X連鎖視網(wǎng)膜色素變性(XLRP)與RP2基因突變
　　 目的：在8個明確X連鎖視網(wǎng)膜色素變性(XLRP)，已排除RPGR基因突變的先證者中尋找RP2基因突變，并研究其相關(guān)表型。
　　 材料方法：從眼遺傳病資源庫中，選取8個XLRP的先證者及其家族成員，和185例無親緣關(guān)系正常對照。對RP2基因的編碼區(qū)進行直接測序分析。
　　 第2章中高度近視與COL2A1基因多態(tài)的關(guān)聯(lián)分析
　　

3、 目的：研究COL2A1基因多態(tài)與中國人群中高度近視易感性的關(guān)系。
　　 材料方法：從眼遺傳病資源庫的大學生人群基因組DNA庫中，選取383名雙眼球鏡超過-4.00D的中高度近視患者(病例組)和384名散瞳后雙眼等效球鏡在-0.50D～+2.00D的對照(對照組)。用直接測序方法對COL2A1基因的SNPsrs1635529、rs60542319、rs1635530、rs1635531、rs954326)進行基因分型，對兩組間基

4、因型分布、等位基因分布和單倍型分布進行統(tǒng)計分析(卡方檢驗)，P<0.01時認為有統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)論：在我們所研究的人群內(nèi)，COL2A1基因的rs1635529、rs60542319、rs1635530、rs1635531和rs954326等5個SNPs與中高度近視間未發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)，不支持COL2A1基因多態(tài)與中高度近視易感性相關(guān)的報道。
　　 第3章 Waardenburg綜合征與PAX3基因突變
　　 目的：

5、研究國人Waardenburg綜合征的PAX3突變特點及其表型特征。
　　 材料方法：從眼遺傳病資源庫中，選取臨床懷疑Waardenburg綜合征的11個先證者，和100名無親緣關(guān)系的正常對照。對PAX3基因的編碼區(qū)進行直接測序分析。復雜突變經(jīng)克隆測序證實。
　　 結(jié)論：結(jié)果豐富了對PAX3突變頻譜及基因型和表型相互關(guān)系的認識。
　　 第4章小瞼裂綜合征(BPES)與FOXL2基因突變
　　 目的：研究中

6、國人群中小瞼裂綜合征患者中FOXL2突變類型及其相關(guān)特點。
　　 材料方法：從眼遺傳病資源庫中，選取13個先天性小瞼裂綜合征家系的先證者及其家系成員，和100名無親緣關(guān)系的正常對照。對FOXL2基因的編碼區(qū)進行直接測序分析。并用限制性片段長度多態(tài)(RFLP)和異源雙鏈-單鏈構(gòu)象多態(tài)(HA-SSCP)進行家系中突變與疾病的共分離分析。對復雜突變進行克隆測序證實。
　　 結(jié)論：結(jié)果豐富了對FOXL2突變頻譜及基因型和表型相互

7、關(guān)系的認識。
　　 第二部分 RP2與NYX蛋白質(zhì)相互作用研究
　　 NYX基因(nyctalopin on chromosome X，OMIM300278)位于Xp11.4，編碼有481個氨基酸殘基的nyctalopin蛋白，屬于SLRP(smallleucine-rich repeat proteins/proteoglycans)家族的一員。文獻報道nyctalopin在視網(wǎng)膜組織主要分布在光感受器細胞與雙極細胞相

8、聯(lián)系的外叢狀層，參與視錐細胞和視桿細胞ON通道(ON-pathway)信號傳導。NYX突變影響桿細胞ON通道正常功能，臨床表現(xiàn)為先天性靜止性夜盲(CSNB1,OMIM310500)。NYX突變所致的先天性靜止性夜盲患者都有中高度近視(絕大部分為高度近視)，推測NYX突變直接參與誘導近視形成。迄今有11個基因突變可導致先天性靜止性夜盲(RetNet: http://www.sph.uth.tmc.edu/retnet/)，多數(shù)基因突變所致

9、CSNB患者不伴近視，說明近視的發(fā)生與先天性靜止性夜盲無關(guān)，而與特定基因相關(guān)。NYX突變影響錐細胞ON通道，很可能與近視有關(guān)。
　　 既往的研究發(fā)現(xiàn)，NYX突變除了會導致伴夜盲的高度近視外，還可以導致不伴夜盲的非綜合征性高度近視。因此，研究nyctalopin蛋白的定位、以及與相近功能蛋白的作用，探索NYX基因突變導致近視形成相關(guān)通路，不僅有可能揭示突變nyctalopin誘發(fā)近視的分子機制，還為尋找其它近視相關(guān)基因提供線索。<

10、br>　　 GRM6基因(metabotropic glutamate receptor6，OMIM604096)位于5q35，編碼有877個氨基酸殘基的代謝型谷氨酸受體6(MGLUR6)。GRM6特異性在視網(wǎng)膜ON雙極細胞表達。GRM6突變會導致常染色體隱性先天性靜止性夜盲，視覺電生理變化為Schubert- Bornschein型并與NYX突變患者的視覺電生理變化相同、但與其它類型先天型靜止型夜盲不同。GRM6突變所致先天性靜止性

11、夜盲患者常伴中高度近視。Nyctalopin和MGLUR6有許多共同點：都可以在視網(wǎng)膜雙極細胞表達，都參與視網(wǎng)膜ON信號通路，突變均導致先天性靜止性夜盲并多伴近視，視覺電生理改變相同。因此，研究這兩個蛋白的表達及相互作用，有可能為揭示近視相關(guān)機制提供線索。
　　 RP2基因(retinitis pigmentosa2,OMIM300757)位于Xp11,編碼有350個氨基酸殘基的RP2蛋白。RP2是細胞質(zhì)膜相關(guān)蛋白，但是功能不明

12、，其多肽N端與微管蛋白(tubulin)特異性伴侶蛋白co-factorC相似，C端功能域與NDK相似。RP2已被確認為X連鎖視網(wǎng)膜色素變性(X-Iink RP)的一個致病基因。高度近視作為一種伴發(fā)癥狀，在NYX和RP2基因突變病人與許多其他表型共存。研究這兩個蛋白的表達和相互作用，將有助于深入了解NYX和RP2的功能和致病機理，同時為研究高度近視病因及分子機理提供線索。
　　 本課題從視網(wǎng)膜組織定位、細胞內(nèi)定位、蛋白相互作用三

13、個方面探討NYX基因編碼蛋白nyctalopin的功能。首先在小鼠和人視網(wǎng)膜組織通過免疫熒光染色研究nyctalopin蛋白的分布；然后在大鼠RGC5神經(jīng)節(jié)細胞內(nèi)研究內(nèi)源蛋白定位，并且在RGC5表達nyctalopin重組融合蛋白并研究定位；最后通過細胞免疫熒光染色、免疫共沉淀、免疫印跡等分子生物學技術(shù)，尋找與nyctalopin相互作用的蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RP2蛋白，MGLUR6蛋白是nyctalopin的兩個相互作用蛋白，可能存在nyc

14、talopin/RP2/MGLUR6蛋白相互作用網(wǎng)絡。研究結(jié)果為揭示近視相關(guān)機制提供了有價值的線索。
　　 第1章 NYX編碼蛋白nyctalopin在眼球組織的定位研究
　　 目的：研究nyctalopin在小鼠和人視網(wǎng)膜組織分布。
　　 材料方法：小鼠和人的視網(wǎng)膜組織切片，應用免疫熒光化學染色技術(shù)，用nyctalopin抗體染色后熒光顯微鏡觀察nyctalopin定位。
　　 結(jié)論：本研究重新定位了n

15、yctalopin在小鼠視網(wǎng)膜組織的定位，與以往報道主要分布在外叢狀層(OPL)不同。本研究首次在人視網(wǎng)膜研究nyctalopin分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要分布在光感受器的內(nèi)節(jié)部分(IS)、外核層(ONL)和外叢狀層(OPL)。雖然我們的觀察結(jié)果尚有待進一步的使用多種不同的nyctalopin抗體予以證實，研究結(jié)果仍然豐富了我們對nyctalopin蛋白在視網(wǎng)膜組織中分布的認知，為進一步研究其蛋白質(zhì)功能提供了依據(jù)。
　　 第2章 Ny

16、ctalopin的細胞內(nèi)定位研究
　　 目的：探索內(nèi)源性和重組融合nyctalopin蛋白在大鼠神經(jīng)節(jié)細胞系RGC5的細胞內(nèi)分布。
　　 材料方法：在大鼠RGC5神經(jīng)節(jié)細胞系用nyctalopin抗體免疫熒光化學染色后熒光顯微鏡觀察內(nèi)源性nyctalopin在細胞內(nèi)的分布。體外構(gòu)建融合蛋白表達重組體，克隆到帶有紅色熒光蛋白的載體pCS2-mRFP-N1上。共轉(zhuǎn)染融合蛋白mRFP-nyctalopin表達質(zhì)粒與綠色熒光標記

17、的細胞色素c氧化酶蛋白EGFP-mito表達質(zhì)粒(細胞色素c氧化酶分布于線粒體膜，用以標記線粒體)到RGC5細胞，24h后采用熒光顯微鏡活體直接熒光觀察融合蛋白表達。應用免疫印跡檢測融合nyctalopin的亞細胞定位。
　　 第3章 nyctalopin相互作用蛋白的研究
　　 目的：尋找能與nyctalopin相互作用的蛋白。研究nyctalopin與候選蛋白RP2,MGLUR6是否相互作用。
　　 材料方法

18、：以RGC5細胞為材料，應用免疫熒光染色技術(shù)和免疫共沉淀技術(shù)，從蛋白細胞內(nèi)共定位和蛋白體外結(jié)合兩方面研究nyctalopin與RP2蛋白，nyctalopin與MGLUR6蛋白是否存在相互作用。免疫熒光染色檢測nyctalopin與RP2,nyctalopin與MGLUR6蛋白在RGC5細胞的定位分布。免疫共沉淀用RP2抗體從RGC5細胞裂解液中富集內(nèi)源性RP2,檢測蛋白復合物中是否存在nyctalopin和MGLUR6。進一步表達帶有