牛同種及山羊-牛異種克隆胚胎體外培養(yǎng)的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)?？寺∨咛ヒ约吧窖?牛核移植胚胎的體外培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，并且研究了在培養(yǎng)過(guò)程中不同時(shí)間添加不同大分子物質(zhì)對(duì)于胚胎發(fā)育的影響。從而建立一套較為系統(tǒng)、穩(wěn)定、高效的胚胎培養(yǎng)體系，提高胚胎體外囊胚發(fā)育率，為提高制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、克隆動(dòng)物、試管動(dòng)物等的效率提供技術(shù)平臺(tái)，為該技術(shù)走出實(shí)驗(yàn)室，在實(shí)踐中得以應(yīng)用提供理論依據(jù)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果為： 1.以DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，對(duì)供體牛以及山羊胎兒耳朵組織塊進(jìn)行組織塊法培養(yǎng)，又以0.2％膠原酶Ⅱ

2、和0.25％胰蛋白酶(Trypsin)按2：3的比例配成混合消化液消化山羊胎兒供體組織，以2.5 g/L胰蛋白酶+1 mmol/L EDTA(Gibco BRL)消化液消化牛胎兒供體組織，結(jié)果兩種方法都獲得了體外培養(yǎng)的胎兒耳朵成纖維細(xì)胞。可在含10％DMSO(二甲亞諷)的冷凍液中于-70℃條件下短期凍存，也可在-196℃條件下長(zhǎng)期保存。 2.通過(guò)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射法將牛和山羊胎兒耳朵成纖維細(xì)胞移入去核的牛卵母細(xì)胞中構(gòu)建重組胚胎以及山羊

3、-牛異種胚胎，分別采用mCR2aa以及mSOF進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明：mSOF液中培養(yǎng)同種胚胎和異種胚胎的卵裂率、8/16-cell發(fā)育率，囊胚發(fā)育率以及囊胚細(xì)胞數(shù)均明顯高于mCR2aa中的培養(yǎng)結(jié)果。(同種依次為74.4±6.5％Vs54.2±4.3％、45.1±6.2％Vs31.5±2.9％、18.5±2.3％Vs9.3±1.8％以及98.2±4.3 Vs78.4±4.1，異種依次為46.6±3.7％Vs36.4±5.1％、30.4±3.

4、8％Vs 20.3±3.2％、8.8±2.1％Vs 3.7±1.5％以及81.1±3.2 Vs68.0±2.5)(P<0.05)。 3.在mSOF中按不同培養(yǎng)時(shí)間添加8mg/mlBSA或者10％FBS，培養(yǎng)前三天和培養(yǎng)三天后添加的補(bǔ)充物質(zhì)及次序?yàn)椋?1)BSA+FBS；(2)BSA+BSA；(3)FBS+BSA；(4)FBS+FBS。結(jié)果表明：添加NBSA+FBS和BSA+BSA的培養(yǎng)體系培養(yǎng)的同種胚胎和異種胚胎卵裂率(同種為7

5、9.8±7.1％及74.0±3.6％，異種為40.1±6.3％及36.2±2.7％)均比添加FBS+BSA，F(xiàn)BS+FBS的培養(yǎng)體系結(jié)果明顯高(同種為49.8±5.1％及49.5±2.4％，異種為26.1±3.2％及23.4±2.8％)(P<0.05)。添加BSA+FBS培養(yǎng)的同種胚胎及異種胚胎的8/16-cell發(fā)育率，囊胚發(fā)育率和轉(zhuǎn)基因牛數(shù)均比其他組高(同種8/16-cell發(fā)育率為49.7±3.5％Vs37.5±2.6％Vs20.

6、4±2.4％Vs19.0±2.1％；同種囊胚發(fā)育率為：21.5±1.8％Vs10.9±2.0％Vs5.0±2.3％Vs4.3±2.0％；同種囊胚細(xì)胞數(shù)依次為115.2±4.3 Vs 103.4±4.4 Vs 101.1±5.2 Vs 102.9±7.7，異種8/16-cell發(fā)育率為29.2±2.0％Vs18.1±2.2％Vs19.9±2.8％Vs18.2±2.6％；異種囊胚發(fā)育率為13.4±2.1％Vs6.9±2.1％Vs3.3±1.