牛體外受精胚胎及克隆胚胎發(fā)育過程中組蛋白修飾表觀遺傳重編程的研究.pdf

1、雖然體細(xì)胞克隆技術(shù)已經(jīng)在多種動(dòng)物中得以實(shí)現(xiàn),但克隆胚胎懷孕率低、出生后異常等問題,嚴(yán)重制約了體細(xì)胞克隆技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用。有研究證實(shí),供體細(xì)胞核在受體卵母細(xì)胞中不完全或異常的表觀遺傳重編程是導(dǎo)致克隆胚胎發(fā)育異常的重要原因。基因組DNA甲基化、組蛋白的共價(jià)修飾是重要的表觀遺傳修飾,二者具有復(fù)雜而廣泛的生物學(xué)功能。在正常生殖細(xì)胞發(fā)生和胚胎發(fā)育過程中,染色體要經(jīng)歷廣泛的DNA甲基化、去甲基化,核小體核心組蛋白也要通過各種共價(jià)修飾調(diào)節(jié)染色體功能,從

2、而完成遺傳信息的傳遞和調(diào)控胚胎的發(fā)育。目前,雖然已初步證實(shí)克隆胚胎存在DNA甲基化的異常,但組蛋白共價(jià)修飾是否也存在異常,還不是很清楚。為了深入探討克隆胚胎組蛋白修飾的重編程,闡明胚胎的發(fā)育機(jī)理,進(jìn)而改善克隆效率,本研究較系統(tǒng)的探討了牛卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精及胚胎體外發(fā)育過程中組蛋白修飾的動(dòng)態(tài)變化,比較了體外受精胚胎與克隆胚胎早期發(fā)育過程中組蛋白修飾的差異。使用組蛋白去乙?；敢种苿?duì)供體細(xì)胞及受體卵母細(xì)胞進(jìn)行了處理,檢測(cè)了藥物對(duì)供

3、、受體表觀遺傳修飾以及克隆胚胎發(fā)育的影響,并對(duì)處理后供體核在去核卵母細(xì)胞中組蛋白修飾的重編程進(jìn)行了分析。 本研究探討了組蛋白H3、H4不同甲基化、乙?；揎椢稽c(diǎn)在牛卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精及胚胎體外發(fā)育不同階段的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示,組蛋白H3、H4甲基化、乙?；哂忻黠@的階段性變化。在卵母細(xì)胞成熟過程中,不同組蛋白不同修飾位點(diǎn)經(jīng)歷階段性的、特異性去乙?；?組蛋白甲基化則在卵母細(xì)胞成熟過程中沒有明顯變化。在精卵融合、精子核解凝集

4、和重凝集過程中,乙?；M蛋白H3、H4迅速定位于精子染色質(zhì),隨后強(qiáng)的乙?；盘?hào)定位于雄原核。與此同時(shí),在卵母細(xì)胞核中,除H4K5ac,并沒有檢測(cè)到其他乙?；盘?hào)；到染色質(zhì)重新凝集時(shí),檢測(cè)到弱乙?；盘?hào)(H3K9ac、H4K5ac、H4K8ac);而到雌原核形成時(shí),乙?；揎椉訌?qiáng)。 甲基化的H3K9me2和H3K4me3熒光信號(hào)在精子核膨大期和染色質(zhì)再凝集期并沒有出現(xiàn)；到原核形成時(shí),雄性染色體組蛋白才逐漸被甲基化。與此同時(shí),上述組

5、蛋白甲基化信號(hào)在卵母細(xì)胞原核形成過程中維持了較高的水平。 在隨后的胚胎發(fā)育過程中,所研究的四種乙?；M蛋白均存在于牛胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期,其中組蛋白H3K9ac,H3K18ac在8-細(xì)胞期明顯減弱,到桑椹胚時(shí)增強(qiáng)。H4K8ac,H4K5ac在胚胎發(fā)育的不同階段都具有較強(qiáng)的熒光信號(hào),但在2-、4-和8-細(xì)胞期胚胎的間期卵裂球中,H4K8ac、H4K5ac定位于細(xì)胞核周邊；而在分裂相的卵裂球中,H4K8ac、H4KSac定位于凝聚染色

6、體,且H4K5ac信號(hào)明顯減弱。H3K18ac、H4K8ac、H4K5ac信號(hào)在囊胚滋胚層的染色較內(nèi)細(xì)胞團(tuán)強(qiáng)。與組蛋白乙酰化相比,甲基化H3K4在8-細(xì)胞期幾乎完全消失,在隨后的發(fā)育過程中,熒光信號(hào)有所恢復(fù),而H3K9me2在8-細(xì)胞以后各期胚胎中則明顯增強(qiáng)。上述結(jié)果表明,卵母細(xì)胞成熟有其特異的組蛋白修飾動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變,組蛋白乙?；饾u被去除；受精是組蛋白甲基化、乙?；饾u恢復(fù)的過程,且不同修飾位點(diǎn)有其自身的動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)；在胚胎發(fā)育過程中維持

7、了組蛋白乙?；⒓谆揎?。在受精及胚胎發(fā)育過程中,相同組蛋白的不同位點(diǎn)有相似的變化模式(H3K9ac vsH3K18ac;H4K8ac vs H4K5ac);功能相關(guān)的不同組蛋白修飾有其類似的動(dòng)態(tài)變化(H3K9ac、H3K18ac vs H3K4me3),并且組蛋白乙酰化在牛胚胎細(xì)胞核中的定位也可能與合子基因組激活有關(guān)(H4K8ac、H4K5ac);而且組蛋白修飾與DNA甲基化密切相關(guān)(H3K9me2)。 2.牛體外受精胚胎與體細(xì)胞克

8、隆胚胎發(fā)育過程中組蛋白修飾的比較通過體細(xì)胞克隆技術(shù)構(gòu)建重構(gòu)胚胎并與體外受精來源的胚胎對(duì)組蛋白修飾的差別進(jìn)行了比較。間接免疫熒光技術(shù)顯示,從原核期到8-細(xì)胞期,克隆胚胎與體外受精胚胎存在著明顯的組蛋白乙?；⒓谆揎椀牟町?。高水平的H3K9ae、H3K18ac、H4K5ac、H4K8ac、H3K4me3和H3K9me2存在于8-細(xì)胞期之前的各期克隆胚胎中,并且H4K5ac和H4K8ac在克隆胚胎細(xì)胞核中的定位與體外受精胚胎也存在明顯差異

9、。8-細(xì)胞期以后,除了H3K9me2,其他組蛋白乙?；?、甲基化修飾的熒光強(qiáng)度及定位,在克隆胚胎都與體外受精胚胎類似。因此,克隆胚8-細(xì)胞前的發(fā)育階段,存在著明顯的組蛋白修飾異常,但當(dāng)供體核基因組被激活,供體核組蛋白修飾經(jīng)歷較大程度的重編程,使得克隆胚胎與體外受精胚胎具有類似的組蛋白修飾模式。 3.TSA處理轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞對(duì)克隆胚胎發(fā)育的影響Trichostatin A(TSA)作為特異的組蛋白去乙?；敢种苿?能夠增加細(xì)胞的組蛋白

10、乙酰化水平,激活基因的表達(dá),本試驗(yàn)使用TSA處理轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞,并對(duì)基因組DNA甲基化水平、組蛋白乙?；健?bào)告基因的表達(dá)及克隆胚胎的發(fā)育進(jìn)行了分析。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞對(duì)TSA存在明顯的劑量效應(yīng),TSA濃度為100ng/mL時(shí),產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性,大量細(xì)胞死亡(P<0.01)。當(dāng)TSA在較低濃度(5-50ng/mL)時(shí),細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞增殖明顯被抑制,S期細(xì)胞明顯減少,細(xì)胞被抑制于G0/G1期。核型分析顯示,TSA處理沒有導(dǎo)

11、致轉(zhuǎn)基因細(xì)胞異常核型的形成。使用10-50ng/mL TSA處理供體細(xì)胞,明顯增加了表達(dá)報(bào)告基因細(xì)胞的數(shù)量,基因組DNA甲基化水平降低,組蛋白乙酰化水平增加。使用經(jīng)TSA處理的體細(xì)胞作為核供體進(jìn)行核移植,獲得了類似的卵裂、桑椹胚及囊胚率。當(dāng)TSA濃度為50ng/mL時(shí),抑制了桑椹胚(14.8％vs 27.3％、38.9％,P<0.05),囊胚的發(fā)育(9.9％vs 20.7％、26.3％,P<0.05)。轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞經(jīng)TSA處理后,表達(dá)e

12、GFP基因的囊胚數(shù)明顯增加。結(jié)論:TSA處理供體細(xì)胞明顯改變了轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞的表觀遺傳特性,激活報(bào)告基因表達(dá),報(bào)告基因表達(dá)的改變可以作為判定基因組DNA甲基化水平轉(zhuǎn)變的標(biāo)志。TSA處理供體細(xì)胞明顯增加表達(dá)報(bào)告基因的囊胚數(shù),但具有低水平DNA甲基化、高水平組蛋白乙?；霓D(zhuǎn)基因供體細(xì)胞并沒有提高克隆胚胎的發(fā)育率。 4.TSA處理卵母細(xì)胞對(duì)克隆胚胎發(fā)育及表觀遺傳重編程的影響本試驗(yàn)使用組蛋白去乙?；敢种苿?TSA)處理卵母細(xì)胞,探討其

13、對(duì)卵母細(xì)胞組蛋白乙?；?、克隆胚胎發(fā)育及供體細(xì)胞染色質(zhì)重編程的影響。結(jié)果表明卵母細(xì)胞成熟率與TSA濃度呈明顯的劑量相關(guān),較高濃度TSA(>2.5ng/mL)處理,抑制了卵母細(xì)胞體外成熟,卵母細(xì)胞被抑制于MI期(10ng/mL、61.9％vs對(duì)照、31.4％,P<0.05)。分析處理后卵母細(xì)胞核型顯示,TSA(1、10ng/mL)處理沒有明顯影響卵母細(xì)胞的核型(85.5％、85.9％vs 81.8％,P>0.05),且藥物處理后明顯增加了卵

14、母細(xì)胞組蛋白乙酰化水平。TSA處理后的卵母細(xì)胞既促進(jìn)了孤雌胚胎的發(fā)育(0.5ng/mL、28.7％,1ng/mL、36.4％,2.5ng/mL、25.9％,5ng/mL、27.1％vs對(duì)照、19.0％),也促進(jìn)了克隆胚胎的發(fā)育(1ng/mL、39.3％vs對(duì)照、25.7％,P<0.05),但是處理組與對(duì)照組囊胚細(xì)胞數(shù)沒有明顯差異。檢測(cè)兩種克隆胚胎1-細(xì)胞階段的組蛋白修飾顯示,供體細(xì)胞染色質(zhì)在受體中經(jīng)歷去乙?；耙阴；亟?。當(dāng)供體細(xì)胞核發(fā)

15、生早期染色體凝集時(shí),對(duì)照和處理組H3K9ac、H3K18ac熒光信號(hào)消失；對(duì)照組供體染色體H4K8ac明顯減弱,處理組該位點(diǎn)乙酰化消失；體細(xì)胞核H4K5ac信號(hào)在對(duì)照組卵母細(xì)胞中沒有明顯變化,處理組H4K5ac信號(hào)明顯減弱。當(dāng)重構(gòu)胚被激活時(shí),所用組蛋白乙酰化信號(hào)迅速恢復(fù)。TSA處理的卵母細(xì)胞還明顯增加了供體染色質(zhì)的穩(wěn)定性(74.2％vs39.6％,P<0.01)。結(jié)論：相對(duì)高濃度的TSA處理卵母細(xì)胞導(dǎo)致乙?；矫黠@升高,并且高的組蛋白