S1PR3特異性激動(dòng)劑上調(diào)巨噬細(xì)胞ROS水平促進(jìn)細(xì)菌清除改善膿毒癥小鼠預(yù)后.pdf

1、膿毒癥（Sepsis）是指感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合癥，是臨床上一種常見且較難治療的綜合征。膿毒癥具有發(fā)病率高、死亡率高及醫(yī)療負(fù)擔(dān)重等特點(diǎn)，全球每年有超過1800萬嚴(yán)重膿毒癥病例，死亡率高達(dá)30-50％，是重癥監(jiān)護(hù)室（Intensive Care Unit，及ICU）患者的主要死因之一。
　　膿毒癥的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其中感染和炎癥反應(yīng)在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。在膿毒癥早期階段，感染引起促炎癥介質(zhì)的大量釋放，并由此導(dǎo)

2、致嚴(yán)重的組織器官損傷，其中肺臟是膿毒癥的首位受累靶器官。若病情得不到及時(shí)控制，機(jī)體由免疫功能亢進(jìn)轉(zhuǎn)為免疫功能抑制，使得原發(fā)病原微生物和機(jī)會(huì)感染菌大量繁殖，最終導(dǎo)致患者死亡。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體固有免疫系統(tǒng)中的重要效應(yīng)細(xì)胞在免疫監(jiān)視及防御中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。病原體可誘發(fā)巨噬細(xì)胞分泌多種生物活性物質(zhì)，如NO、TNF-α、ROS等，其中ROS作為第二信使參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，是重要的免疫調(diào)節(jié)因子。細(xì)胞內(nèi)適宜濃度的ROS可干擾細(xì)菌的DNA轉(zhuǎn)錄和三磷酸腺苷

3、(adenosine triphosphate，ATP)合成，殺滅病菌或破壞細(xì)胞膜、干擾酶的功能，從而清除微生物。
　　盡管以TLRs為首的模式識(shí)別受體及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在膿毒癥的發(fā)病機(jī)制中占據(jù)十分重要的地位，但近些年來的研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)TLRs為靶向的膿毒癥治療并未取得理想效果。S1P受體（Sphingosine1-phosphate receptor，S1PRs）是一類G蛋白偶聯(lián)受體，與磷酸分子1-磷酸硝胺醇（Sphingos

4、ine1-phosphate，S1P）結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)，介導(dǎo)S1P發(fā)揮其第一信使作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，血管生成和炎癥反應(yīng)。S1PR3作為S1PRs家族中一個(gè)主要成員，它與三種G蛋白發(fā)生偶聯(lián)(Gi、Gq、G12/G13)，介導(dǎo)了廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。當(dāng)前，對(duì)S1PR3調(diào)控中樞及外周固有免疫細(xì)胞促炎作用的研究較為廣泛，而其在病原微生物清除中的作用并不明確。
　　目的：
　　本研究旨在通過第一部分:設(shè)計(jì)合成S1PR3特異性

5、激動(dòng)劑KRX-725，建立腹腔細(xì)菌感染膿毒癥模型，并特異性干預(yù)S1PR3功能，分析S1PR3對(duì)膿毒癥小鼠生存率，細(xì)菌復(fù)合及肺臟損傷的影響。第二部分:體外觀察KRX-725對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(ROS)的調(diào)節(jié)作用，對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)菌清除功能的影響。探討S1PR3參與細(xì)菌清除的功能及其分子機(jī)制。
　　方法：
　　采用大腸桿菌(E.coli)腹腔注射小鼠誘導(dǎo)膿毒癥模型。并采用S1PR3特異性激動(dòng)劑KRX-725于建模后進(jìn)行腹腔注射治療

6、，對(duì)照組給予等體積的溶劑。兩組分別于治療后第8、16、24、32、40、48小時(shí)，觀察膿毒癥小鼠生存率情況。KRX-725治療組及對(duì)照組分別于膿毒癥模型后24h，取外周血及腹腔灌洗液，按比例進(jìn)行梯度稀釋，LB平板培養(yǎng)過夜，計(jì)算出每毫升血液或腹腔灌洗液細(xì)菌集落數(shù)（colony forming units，CFU）。并于建模后24小時(shí)取肺臟組織，固定、制作石蠟切片及HE染色，進(jìn)行肺損傷評(píng)分。體外Fluid Thioglycollate Me

7、dium誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，按比例應(yīng)用E.coli刺激小鼠巨噬細(xì)胞，時(shí)間分別為0 min，10min,20 min，30 min，40 min，50 min和60 min，刺激結(jié)束后，檢測(cè)ROS水平。用同樣方法所得的腹腔巨噬細(xì)胞，進(jìn)行慶大霉素保護(hù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS17.0軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，生存率分析采用Log-rank Test，計(jì)量資料采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，P＜0.05為

8、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠腹腔注射大腸桿菌，成功誘導(dǎo)膿毒癥模型，KRX-725治療組膿毒癥小鼠(n=12)生存率顯著高于對(duì)照組(n=12)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.在KRX-725干預(yù)后24小時(shí)，KRX-725治療組(n=5)每毫升血液中的CFU值顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，兩組的腹腔灌洗液CFU值差異更為顯著(P＜0.01)。
　　3.在KRX-725治療后24h進(jìn)行

9、觀察(n=3)，對(duì)照組有典型的急性肺損傷的組織學(xué)改變，包括肺泡充血、大量炎性細(xì)胞滲出浸潤、彌漫性肺泡損傷等，而KRX-725治療組肺損傷的組織學(xué)變化明顯減輕，其急性肺損傷評(píng)分也顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。
　　4.E.coli體外刺激巨噬細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，KRX-725治療組活性氧(ROS)的水平在第20min時(shí)明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在第30min時(shí)差異最為顯著（P

10、＜0.01）。
　　5.慶大霉素保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，KRX-725治療組細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌存活數(shù)明顯低于對(duì)照組(p＜0.05)，6小時(shí)兩組之間的差異更為顯著(p＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，S1PR3特異性激動(dòng)劑KRX-725可顯著改善膿毒癥小鼠生存率，并降低膿毒癥小鼠24小時(shí)腹腔及血液細(xì)菌負(fù)荷，減輕肺臟損傷。體外研究發(fā)現(xiàn)，S1PR3特異性激動(dòng)劑通過上調(diào)巨噬細(xì)胞中活性氧(ROS)的水平，增強(qiáng)細(xì)胞清除細(xì)菌的能力，改善