WISP1與TLRs激動劑在巨噬細胞中協(xié)同促炎機制的研究.pdf

1、背景：WISP1(CCN4)是Wnt/β-catenin信號通路激活后誘發(fā)轉(zhuǎn)錄的基因之一，其編碼的蛋白屬于CCN蛋白家族，具有多種調(diào)控功能，是連接細胞外基質(zhì)及細胞信號傳導的重要因子。CCN蛋白通過結合整合素受體激活信號通路，而整合素信號通路的激活在急性肺損傷中發(fā)揮重要作用。近來研究發(fā)現(xiàn)WISP1是機械通氣誘導肺損傷的易感基因，而巨噬細胞在肺的炎癥反應中具有重要作用。
　　目的：本研究擬在巨噬細胞模型中探討WISP1單獨或與TLRs

2、激動劑共同刺激對巨噬細胞炎癥因子分泌的影響，以揭示W(wǎng)ISP1在炎癥發(fā)生中的作用機制，為WISP1介入治療急性肺損傷提供新的理論基礎。
　　方法：首先在細胞水平，觀察WISP1在炎癥反應中的作用，通過ELISA檢測細胞培養(yǎng)基中促炎因子TNF-α的水平，比較直接給予WISP1刺激或RGDs預處理阻斷整合素通路后WISP1刺激對巨噬細胞分泌炎性因子的影響，并通過免疫印跡檢測下游信號因子p38MAPK、NF-κB的磷酸化水平，在分子水平探

3、討細胞內(nèi)的信號傳導機制。其次通過分離脂筏或免疫熒光的方法檢測WISP1單獨或與LPS共同刺激對TLR4受體復合物向脂筏募集過程的影響。再次，觀察TLRs激動劑刺激對巨噬細胞中整合素表達水平影響，并通過TLR相關通路基因敲除小鼠（TLR4、CD14、TRIF）驗證TLR通路的完整性對整合素表達的重要性。最后，觀察WISP1與TLRs激動劑共同刺激巨噬細胞后，巨噬細胞炎癥反應性的變化，明確WISP1-整合素信號通路與TLR通路間的相互影響在

4、炎癥反應中的作用。
　　結果：⑴WISP1單獨刺激RAW264.7細胞后，p38MAPK，NF-κB(P65)的磷酸化水平增加，促炎因子TNF-α的分泌增加(P＜0.01)。RGDS預處理阻斷整合素結合后，抑制TNF-α的分泌(P＜0.05)。表明整合素受體介導了WISP1的促炎作用。⑵WISP1增加MD2、整合素β3在脂筏分布。TLRs激動劑刺激原代腹腔巨噬細胞后，AKT、p38MAPK、NF-κB通路磷酸化水平增加，整合素β1

5、，整合素β3的表達水平上調(diào)(P＜0.01)，敲除TLR相關通路基因（TLR4、CD14、TRIF）后TLRs激動劑上調(diào)整合素表達的作用降低甚至消失。此結果表明TLRs炎性信號通路的激活可上調(diào)WISP1整合素受體的表達。⑶WISP1與TLRs激動劑共同刺激細胞后，TNF-α的水平較二者單獨刺激明顯增加(P＜0.05)，RGDS預處理后，二者共同作用與單獨刺激無明顯差異。進一步證明整合素受體介導了WISP1與TLRs激動劑之間的協(xié)同促炎作用