年齡相關(guān)性巨噬細(xì)胞極化對(duì)骨修復(fù)再生作用的研究.pdf

1、第一部分細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的小鼠全身系統(tǒng)性炎癥對(duì)骨再生的影響
　　目的:骨折修復(fù)有賴于骨骼系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的密切配合。在諸如某些病理情況如多發(fā)性創(chuàng)傷,糖尿病,風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,肥胖,衰老等某些基礎(chǔ)炎癥水平高于正常的情況均能導(dǎo)致骨再生的速度和質(zhì)量下降。本實(shí)驗(yàn)的目的在于應(yīng)用細(xì)菌脂多糖構(gòu)建一種高基礎(chǔ)炎癥狀態(tài)模型,以探討單純炎癥狀態(tài)下骨折愈合的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制。
　　方法:對(duì)10周大C57BL/6老鼠用三點(diǎn)加壓模型造成非穩(wěn)定性骨折后,連續(xù)7天經(jīng)

2、腹腔注射LPS(3μg/天/老鼠),對(duì)照組老鼠注射同等劑量的LPS。分別在骨折的第1天,第3天,第7天,第10天,第14天,第21天心臟采血法收集血漿,并收集骨折側(cè)肢體。用雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)血漿中IL-6水平。骨折側(cè)肢體經(jīng)過(guò)固定,脫鈣,透明,石蠟包埋后進(jìn)行石蠟切片。間隔10張切片分別行HallBryant染色。顯微鏡計(jì)算每張切片上骨痂大小及成分。選取Cab2T3和ADTC5兩種細(xì)胞系分別在不同濃度LPS存在下進(jìn)行成骨化和成軟骨

3、化誘導(dǎo),應(yīng)用茜素紅和阿爾新藍(lán)染色判斷成骨化和成軟骨化程度。
　　結(jié)果:LPS連續(xù)7天注射后,LPS組老鼠未出現(xiàn)明顯發(fā)熱,體重降低,活動(dòng)減少等癥狀。血清學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在骨折后24小時(shí)LPS與PBS對(duì)照組血漿內(nèi)IL-6水平達(dá)到峰值,但是LPS組IL-6峰值水平遠(yuǎn)高于PBS對(duì)照組。骨折后3天,對(duì)照組血漿中炎性因子即恢復(fù)至基礎(chǔ)水平,但是LPS組在7天時(shí)才緩慢恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在骨折后第7天,第10天和第14天,LPS組骨痂大

4、小較對(duì)照比明顯減小。新生軟骨和新生骨體積LPS組也顯著小于對(duì)照組,但軟骨減少更為明顯。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,LPS能明顯抑制成骨作用和成軟骨化作用。
　　結(jié)論:通過(guò)腹腔注射LPS可以系統(tǒng)性基礎(chǔ)炎癥水平增高,系統(tǒng)性炎癥水平升高能導(dǎo)致局部骨再生減緩,同時(shí)影響骨再生質(zhì)量。
　　第二部分骨折修復(fù)過(guò)程中巨噬細(xì)胞的作用及其表型演變
　　目的:骨折發(fā)生后,正常機(jī)體能有效募集各種炎性細(xì)胞對(duì)組織損傷相關(guān)刺激進(jìn)行應(yīng)答,清除炎癥并啟動(dòng)組織修復(fù)程

5、序。巨噬細(xì)胞作為先天性免疫系統(tǒng)的重要的效應(yīng)細(xì)胞,能發(fā)揮清除壞死組織,吞噬細(xì)胞碎片,提呈抗原等作用。此外,巨噬細(xì)胞能根據(jù)細(xì)胞外微環(huán)境尤其是周圍組織炎癥水平呈現(xiàn)不同的極化狀態(tài),表現(xiàn)不同的生物學(xué)功能。在上皮組織傷口愈合中,巨噬細(xì)胞的極化和功能變化已經(jīng)大量見(jiàn)諸報(bào)道,本研究旨在應(yīng)用Ccr2-/-基因缺陷型老鼠研究巨噬細(xì)胞在骨折愈合過(guò)程中的作用以及在骨折過(guò)程中的表型的動(dòng)態(tài)改變。
　　方法:實(shí)驗(yàn)采用10周大小的Ccr2-/-老鼠作為干預(yù)組,年齡

6、與性別相匹配的正常C57BL/6老鼠作為對(duì)照組,判斷Ccr2基因在骨折愈合過(guò)程中的作用。運(yùn)用Yet40和Yarg兩種YFP熒光標(biāo)記老鼠來(lái)判斷骨折愈合不同階段M1和M2的數(shù)量。三點(diǎn)加壓法制造非穩(wěn)定性骨折后,不同時(shí)間點(diǎn)收集骨折側(cè)肢體,經(jīng)過(guò)固定,脫鈣,透明,石蠟包埋后進(jìn)行石蠟切片,間隔10張切片分別行HallBryant染色,顯微鏡下計(jì)算每張切片上骨痂大小及成分。另選取每10張組織切片行免疫組織化學(xué)染色,計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。骨折后分別于

7、第1,3,5,7,10,14天在顯微鏡下分離骨痂,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后用qPCR方法檢測(cè)M1和M2相關(guān)基因。在骨折愈合的第1天和第7天,選取Yet40和Yarg熒光標(biāo)記鼠組織切片做抗YFP染色探討骨折修復(fù)過(guò)程中巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。
　　結(jié)果:骨折后第3天,與正常組相比,Ccr2-/-老鼠骨折局部巨噬細(xì)胞明顯減少,但是中性粒細(xì)胞數(shù)量并未出現(xiàn)顯著下降。骨折第7天,Ccr2-/-基因缺陷鼠較野生型老鼠相比,骨折后骨痂大小顯著性減小(P

8、=0.27),新生骨痂中骨含量和軟骨含量?jī)山M之間并無(wú)明顯差異。骨折第14天,骨痂大小無(wú)明顯差異,對(duì)照組新生骨含量明顯多于Ccr2-/-缺陷組。骨折后第21天,Ccr2-/-組骨痂中新生骨體積和軟骨體積均高于對(duì)照組。Yet40和Yarg組實(shí)驗(yàn)組提示,骨折后第1天,M1數(shù)量明顯高于M2,至骨折第7天,結(jié)果顯示M1巨噬細(xì)胞數(shù)量減少而M2數(shù)量增多。
　　結(jié)論:Ccr2基因缺陷老鼠能阻止巨噬細(xì)胞向機(jī)體損傷部位募集從而導(dǎo)致骨折愈合延緩,新生骨

9、數(shù)量和質(zhì)量明顯降低,進(jìn)一步說(shuō)明巨噬細(xì)胞在骨修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。骨折愈合過(guò)程中,巨噬細(xì)胞表型由M1逐漸向M2表型轉(zhuǎn)變,從促炎癥表型向抗炎癥表型轉(zhuǎn)變,這一轉(zhuǎn)變對(duì)清除創(chuàng)傷后局部炎癥,促進(jìn)組織修復(fù)發(fā)揮積極作用。
　　第三部分年齡相關(guān)性巨噬細(xì)胞極化對(duì)成骨細(xì)胞成骨化作用的影響
　　目的:巨噬細(xì)胞作為一種主要的先天性免疫應(yīng)答細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞在骨折愈合中發(fā)揮重要作用,年齡能影響巨噬細(xì)胞的表型和功能,同時(shí)巨噬細(xì)胞也能根據(jù)細(xì)胞外微環(huán)境的改

10、變而呈現(xiàn)不同的細(xì)胞表型。在組織損傷發(fā)生后,一般認(rèn)為巨噬細(xì)胞首先呈現(xiàn)促炎表型M1,引發(fā)炎癥和機(jī)體免疫應(yīng)答,隨著炎癥的消退,巨噬細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N抗炎表型M2,分泌細(xì)胞外基質(zhì)合成膠原等促進(jìn)組織修復(fù)。本部分研究旨在探討年齡對(duì)巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的影響,以及在這種年齡相關(guān)的極化狀態(tài)下,巨噬細(xì)胞與成骨細(xì)胞的相互作用。
　　方法:不同年齡組老鼠處死后,收集骨髓中單核細(xì)胞。用含有5％CMG12-14細(xì)胞系上清液的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)單核細(xì)胞誘導(dǎo)生成

11、小鼠巨噬細(xì)胞。10ng/mlIFN-γ與10ng/mlLPS加入培養(yǎng)基過(guò)夜,誘導(dǎo)生成M1型巨噬細(xì)胞,1ng/mlIL-4培養(yǎng)12小時(shí)誘導(dǎo)生成M2型巨噬細(xì)胞。用ELISA方法分別測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)上清液中有關(guān)抗炎因子和促炎因子的濃度。用Giess試劑盒測(cè)量M1巨噬細(xì)胞上清中的NO含量,用Q-PCR方法檢測(cè)M2巨噬細(xì)胞中的YM1和FIZZ1基因的含量,證實(shí)巨噬細(xì)胞已活化為目的表型。分別用三種共培養(yǎng)的方式培養(yǎng)巨噬細(xì)胞和成骨前體細(xì)胞1)標(biāo)準(zhǔn)法混合培養(yǎng)

12、2)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)3)Trans-well小室培養(yǎng)。用Q-PCR的方法分別在誘導(dǎo)分化的第3天,第7天,第10天,第14天分別檢查成骨分化的相關(guān)基因ALP,Col1a和Osterix表達(dá)情況。在共培養(yǎng)14天后用茜素紅染色和堿性磷酸酶活性檢測(cè)的方法來(lái)判斷成骨化作用。
　　結(jié)果:18月組小鼠巨噬細(xì)胞IL-6水平較10周組明顯升高。M1標(biāo)志物NO和M2標(biāo)志物YM1和FIZZ1,18月組均高于10周組。Q-PCR結(jié)果顯示,10周和18周未活

13、化骨髓巨噬細(xì)胞對(duì)成骨細(xì)胞成骨化并未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性。對(duì)于M1巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下分化的成骨細(xì)胞,早期時(shí)間點(diǎn)成骨化相關(guān)基因表達(dá)水平高于對(duì)照,但是晚期時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平低于同年齡組對(duì)照。M2條件培養(yǎng)基下,10周組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)成骨化基因均高于正常,而18周M2組與同年齡組對(duì)照并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。標(biāo)準(zhǔn)法混合培養(yǎng)體系下,各年齡組茜素紅染色顯示鈣結(jié)節(jié)并無(wú)顯著差異。在條件培養(yǎng)基培養(yǎng)和Transwell培養(yǎng)體系下,10周M2組較同年齡M1組相比顯著促進(jìn)

14、鈣結(jié)節(jié)生成。18月組M1和M2組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量均低于同一年齡正常對(duì)照組。
　　結(jié)論:體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)衰老組巨噬細(xì)胞較正常成年組呈現(xiàn)出一種更高的基礎(chǔ)炎性狀態(tài),衰老狀況下巨噬細(xì)胞本身仍然具有向M1和M2極化的能力,并分泌M1,M2特異性標(biāo)記物的能力。這一研究同樣也說(shuō)明在長(zhǎng)期的炎癥環(huán)境下,成骨細(xì)胞成骨作用受損,同時(shí)M2巨噬細(xì)胞表型能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及成骨作用。因此,調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化可能是促進(jìn)如衰老,肥胖,糖尿病等某些長(zhǎng)期慢性炎癥情況下骨折修復(fù)